Aquí, presentamos un método de purificación de afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus que es simple, económico y eficiente.
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Artículo de método
Purificación por afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus
En este artículo
Resumen
Resumen
La enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE) es un nuevo agente fibrinolítico que puede activar el plasminógeno en plasmina y degradar la fibrina directamente, mostrando grandes ventajas sobre los agentes trombolíticos tradicionales. Sin embargo, debido a la falta de información estructural, todos los programas de purificación para sFE se basan en purificaciones por cromatografía de varios pasos, que son demasiado complicadas y costosas. Aquí, se desarrolla por primera vez un protocolo de purificación de afinidad de sFE basado en una estructura cristalina de sFE; incluye la preparación de la muestra cruda y la columna de cromatografía de afinidad de la matriz lisina/arginina-agarosa, la purificación de afinidad y la caracterización del sFE purificado. Siguiendo este protocolo, un lote de sFE se puede purificar en 1 día. Además, la pureza y la actividad del sFE purificado aumentan a 92% y 19,200 U/mL, respectivamente. Por lo tanto, este es un enfoque simple, económico y eficiente para la purificación de sFE. El desarrollo de este protocolo es de gran importancia para la utilización posterior de sFE y otros agentes similares.
Introducción
La trombosis es una amenaza importante para la salud pública, especialmente después de la pandemia mundial de Covid-19 1,2. Clínicamente, muchos activadores del plasminógeno (AP), como el activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA) y la uroquinasa (Reino Unido), se han utilizado ampliamente como fármacos trombolíticos. Los PA pueden activar el plasminógeno de los pacientes en plasmina activa para degradar la fibrina. Así, su eficiencia trombolítica está fuertemente restringida por el estado plasminógeno de los pacientes 3,4. Los agentes fibrinolíticos, como la metaloproteinasa plasmina y la serina plasmina, son otro tipo de fármaco trombolítico clínico que también incluye enzimas fibrinolíticas (FE) como la plasmina, que pueden disolver los coágulos directamente, pero son rápidamente inactivados por varios inhibidores de la plasmina5. Posteriormente, se ha informado de un nuevo tipo de agente fibrinolítico que puede disolver el trombo no solo activando el plasminógeno en plasmina, sino también degradando la fibrina directamente 6-la enzima fibrinolítica del antiguo gusano del maní Sipunculus nudus (sFE)6. Esta bifunción otorga a sFE otras ventajas sobre los fármacos trombolíticos tradicionales, especialmente en términos de estado anormal del plasminógeno. En comparación con otros agentes fibrinolíticos bifuncionales 7,8,9, la sFE muestra varias ventajas, incluida la seguridad, sobre los agentes no derivados de alimentos para el desarrollo de fármacos, especialmente para medicamentos orales. Esto se debe a que la bioseguridad y biocompatibilidad de Sipunculus nudus han sido bien establecidas10.
Al igual que los otros agentes fibrinolíticos naturales aislados de microorganismos, lombrices de tierra y hongos, la purificación de sFE de S. nudus es muy complicada e incluye múltiples etapas, como homogeneización tisular, precipitación de sulfato de amonio, desalinización, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y tamizado molecular10,11,12. Tal sistema de purificación no solo depende de habilidades competentes y materiales costosos, sino que también requiere varios días para completar todo el procedimiento. Por lo tanto, un programa simple de purificación de sFE es de gran importancia para el desarrollo posterior de sFE. Afortunadamente, dos cristales de sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) se han obtenido con éxito (ver Archivo Suplementario 1 y Archivo Suplementario 2). A través del análisis estructural y los experimentos de acoplamiento molecular, encontramos que el núcleo catalítico de sFE podría unirse específicamente a objetivos que contienen residuos de arginina o lisina.
Aquí, se propuso por primera vez un sistema de purificación de afinidad, basado en la estructura cristalina de sFE. Siguiendo este protocolo, la sFE altamente pura y altamente activa podría purificarse a partir de los extractos crudos en una sola etapa de purificación de afinidad. El protocolo desarrollado aquí no solo es importante para la preparación a gran escala de sFE, sino que también se puede aplicar para la purificación de otros agentes fibrinolíticos.
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Protocolo
1. Preparación
- Tratamiento de la muestra
- Diseccionar cuidadosamente S. nudus fresco (100 g) y recoger el intestino y su líquido interno.
- Añadir 300 ml de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) para homogeneización (1.000 rpm, 60 s).
- Congelar-descongelar el homogeneizado 3x.
- Centrifugar la muestra (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) y recoger el sobrenadante. Conservar la muestra a 4 °C hasta su uso posterior.
- Precipitación de proteínas
- Mezclar el sobrenadante con una solución saturada de sulfato de amonio (nueve volúmenes) y dejar reposar la mezcla durante 12 h a 4 °C.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y continuar más tarde. - Centrífuga (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) para obtener el precipitado proteico; Almacénelo a 4 °C para su uso posterior.
- Mezclar el sobrenadante con una solución saturada de sulfato de amonio (nueve volúmenes) y dejar reposar la mezcla durante 12 h a 4 °C.
- Resuspensión proteica
- Resuspender el precipitado proteico con 30 mL de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservar esta solución de proteína cruda a 4 °C para su uso posterior.
2. Cromatografía de afinidad
- Filtración de soluciones
- Filtrar la solución de proteína cruda a través de una membrana filtrante de 0,22 μm. Conservar esta muestra a 4 °C para su uso posterior.
- Embalaje de columnas
- Empaque la columna de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y la columna de cromatografía de afinidad de matriz de lisina-agarosa cargando una cantidad adecuada de medio de matriz de lisina-agarosa y medio de matriz de arginina-agarosa en columnas de cromatografía vacías de 5 ml.
NOTA: La columna se puede almacenar a 2-8 °C, con la matriz sumergida en tampón de almacenamiento (20% de etanol).
- Empaque la columna de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y la columna de cromatografía de afinidad de matriz de lisina-agarosa cargando una cantidad adecuada de medio de matriz de lisina-agarosa y medio de matriz de arginina-agarosa en columnas de cromatografía vacías de 5 ml.
- Purificación de afinidad
- Equilibrar la columna de cromatografía de afinidad con ddH2O primero (1 mL/min, 10 volúmenes de columna), seguido de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, 5 volúmenes de columna).
- Cargue la muestra de solución de proteína en la columna preequilibrada (1 ml/min, volumen de 1/3 columna).
NOTA: El volumen de carga de la muestra depende de la concentración de sFE. - Lave la columna con tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, volúmenes de cinco columnas).
- Eluya la columna con 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M y 0,65 M NaCl (1 ml/min, cinco volúmenes de columna) sucesivamente.
- Busque el pico de elución que debe aparecer en la elución de NaCl 0.15 M y luego recoja las fracciones en tubos de 5 ml.
- Concentrar la muestra de elución utilizando un filtro ultracentrífugo de 3 kD (3.944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservar esta muestra a -80 °C para su uso posterior.
3. Evaluación de la pureza
- Preparación en gel de electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE)
- Preparar el gel SDS-PAGE según el método de Laemmli utilizando gel concentrado al 5% y gel de separación al 12%13.
- Electroforesis
- Mezclar la muestra (15 μL) con 5 tampón de carga de proteínas SDS-PAGE (1/4 volumen), calentar en agua hirviendo durante 5 min, cargar en el gel SDS-PAGE y hacer correr el gel a 80 V, 60 mA durante 1,5 h.
- Análisis
- Después de la electroforesis, tiñe el gel con un kit de tinción de plata, de acuerdo con el protocolo del fabricante, y observe el gel teñido utilizando un sistema de imágenes quimioluminiscentes.
- Analice la pureza de la proteína diana utilizando la siguiente fórmula: pureza de la proteína diana = valor de intensidad de la proteína diana/valor de intensidad de la proteína total.
4. Evaluación de la actividad fibrinolítica
- Preparación de la placa de fibrina
- Preparar la solución de fibrinógeno mezclando 25 mg de fibrinógeno con 1,25 ml de solución salina fisiológica.
- Prepare la solución de trombina mezclando completamente 100 U de trombina con 1,05 ml de solución salina fisiológica.
- Preparar la solución de agarosa añadiendo 0,5 g de agarosa a 22,5 ml de tampón Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Mezclar y calentar la solución de agarosa a 100 °C hasta que se disuelva completamente.
- Enfriar la solución de agarosa hasta unos 50 °C y añadir la solución de fibrinógeno. Luego, agregue inmediatamente la solución de trombina, mézclelos rápidamente y viértalos en una fuente de cultivo de 60 mm.
- Carga
- Perforar pocillos de 3 mm en las placas de fibrina preparadas utilizando un barrenador estéril y llenar los pocillos con muestras de 10 μL.
- Análisis
- Después de 18 h de incubación a 37 °C, medir la actividad fibrinolítica calculando el tamaño de sus zonas degradantes. Actividad fibrinolítica = (tamaño de zona de la muestra/tamaño de zona de la uroquinasa) x 100 U. Tamaño de zona = diámetro x diámetro.
NOTA: Para el control blanco, el control negativo y el control positivo se utilizaron tampón salino fisiológico, proteína cruda (muestra obtenida en el paso 1.3.1 del protocolo) y uroquinasa. En comparación con la uroquinasa, encontramos que la actividad fibrinolítica de la sFE purificada fue ~ 19,200 U / ml.
- Después de 18 h de incubación a 37 °C, medir la actividad fibrinolítica calculando el tamaño de sus zonas degradantes. Actividad fibrinolítica = (tamaño de zona de la muestra/tamaño de zona de la uroquinasa) x 100 U. Tamaño de zona = diámetro x diámetro.
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Resultados
Siguiendo este protocolo, se extrajeron lisados tisulares crudos, se construyeron columnas de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y matriz de lisina-agarosa, se obtuvo sFE purificado y se midió la pureza y actividad fibrinolítica del sFE purificado mediante placas SDS-PAGE y fibrina, respectivamente.
Después de la centrifugación, el sobrenadante recogido era un líquido viscoso de color canela transparente. La precipitación comenzó cuando este sobrenadante se mezcló con una ...
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Discusión
Debido a la falta de disponibilidad de la secuencia génica exacta de sFE, la sFE utilizada actualmente se extrajo de S. nudus14 fresco. Además, los procedimientos de purificación de sFE descritos en la literatura fueron complicados y costosos, ya que se basaron en algunas características generales de sFE, como el peso molecular, el punto isoeléctrico, la fuerza iónica y la polaridad15,16. Hasta la fecha no se ha informado de ningú...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por la Oficina de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Xiamen (3502Z20227197) y la Oficina de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
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Materiales
de imágenes de quimioluminiscencia SANYO BT-100 QITE Centrífuga refrigerada de escritorio DHG Series Horno de calentamiento y secado precisión Oscilador de vórtice sartorio Sistema de electroforesis vertical Tubo de centrífuga Tubo de centrífuga Tubo de centrífuga Tubo de centrífuga NEST Placa de cultivo Membrana de filtro NEST Punta de pipeta Punta de pipeta Punta de pipeta Papel indicador especial Unidad de (15 mL 3 KDa)Unidad de filtro ultracentrífugo Millipore SSS indicador de pH universal Millipore
Sulfato de amonio SINOPHARM Matriz
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 30% Acrilamida-Bisacrilamida (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoetanol | Solarbio | ||
| Agarosa G-10 | Biowest | ||
| Persulfato de amonio | SINOPHARM | ||
| Arginina-Sepharose 4B | Solarbio | Matriz de arginina-agarosa | |
| Azul de bromoxilenol (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Ácido clorhídrico | SINOPHARM | ||
| Kinasa | RHAWN | ||
| Lisina-Sepharose 4B | Solarbio | de lisina-agarosa | |
| N,N,N',N'-Tetrametilemilendiamina (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Marcador de proteínas de color preteñido (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Cloruro de sodio | SINOPHARM | ||
| Dodecil sulfonato de sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Hidróxido de | sodioSINOPHARM | ||
| Trombina | Meilunbio | ||
| Tris (Hidroximetil) Aminometano | Solarbio | ||
| Tris (Hidroximetil) Clorhidrato de aminometano | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Pura Sistema de purificación GE puro | |||
| Esterilizador automático de vapor de presión vertical MLS-3750 | Sistema | ||
| Bomba de flujo constante GE | |||
| Incubadora de temperatura constante | JINGHONG | ||
| 3-30KS | SIGMA | ||
| DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Homogeneizador de vidrio eléctrico DY89-II | SCIENTZ | ||
| Balanza analítica electrónica | DENVER | ||
| Baño de agua electrotermostático DK-S12 | SENXIN | ||
| Agitador de decoloración horizontal | Kylin-Bell | ||
| Máquina de hielo AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Limpiador ultrasónico | ShuMei | ||
| Agitador magnético | Zhi wei | ||
| Micro Centrífuga Refrigerada H1650-W | Cence | ||
| Horno de microondas | Galanz | ||
| Milli-Q Referencia | Millipore | ||
| Pipeta | Thermo Fisher Scientific | ||
| Medidor de pH de escritorio | de | ||
| de tamaño pequeño | Kylin-Bell | ||
| Bio-Rad | |||
| Material consumible | |||
| 200 y micro; Tubo de PCR L (200 y micro; L) | Axygene | ||
| (1,5 mL) | Biosharp | ||
| (5 mL) | Biosharp | ||
| (50 mL) | |||
| (7 mL) | Biosharp | ||
| (60 mm) | |||
| (0,22 y micro; m) | Millex GP | ||
| Parafilm Bemis | |||
| (1 mL) | KIRGEN | ||
| (10 µ L) | Axygene | ||
| (200 y micro; L) | Axygene | ||
| filtro ultracentrífugo TZAKZY | |||
| (4 mL 3 KDa) | Reactivo | ||
Referencias
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Reimpresiones y permisos
