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Medicine

Esplorazione dell'azione farmacologica e del meccanismo molecolare del salidroside nell'inibizione della proliferazione e della migrazione delle cellule MCF-7

Published: June 09, 2023
doi:
10.3791/65634
, , , , , , ,
1Pathology Department,Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery,the Third People’s Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

Summary

Il presente protocollo descrive una strategia completa per valutare l’azione farmacologica e il meccanismo del salidroside nell’inibire la proliferazione e la migrazione delle cellule MCF-7.

Abstract

Il salidroside (Sal) contiene attività farmacologiche anticancerogene, antiipossiche e antinfiammatorie. Tuttavia, i suoi meccanismi anti-cancro al seno sono stati chiariti solo in modo incompleto. Quindi, questo protocollo intendeva decodificare il potenziale di Sal nella regolazione della via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 nella proliferazione maligna delle cellule MCF-7 del carcinoma mammario umano. In primo luogo, l’attività farmacologica di Sal contro MCF-7 è stata valutata mediante CCK-8 e saggi di graffio cellulare. Inoltre, la resistenza delle cellule MCF-7 è stata misurata mediante saggi di migrazione e invasione di Matrigel. Per l’apoptosi cellulare e i saggi del ciclo, le cellule MCF-7 sono state processate in fasi con annessina V-FITC/PI e kit di rilevamento della colorazione del ciclo cellulare per le analisi di citometria a flusso, rispettivamente. I livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e Ca2+ sono stati esaminati mediante colorazione a immunofluorescenza DCFH-DA e Fluo-4 AM. Le attività di Na+-K+-ATPasi e Ca2+-ATPasi sono state determinate utilizzando i corrispondenti kit commerciali. I livelli di espressione proteica e genica nell’apoptosi e nella via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sono stati ulteriormente determinati utilizzando analisi western blot e qRT-PCR, rispettivamente. Abbiamo scoperto che il trattamento con Sal ha limitato significativamente la proliferazione, la migrazione e l’invasione delle cellule MCF-7 con effetti dose-dipendenti. Nel frattempo, la somministrazione di Sal ha anche drammaticamente costretto le cellule MCF-7 a subire l’apoptosi e l’arresto del ciclo cellulare. I test di immunofluorescenza hanno mostrato che Sal stimolava in modo osservabile la produzione di ROS e Ca2+ nelle cellule MCF-7. Ulteriori dati hanno confermato che Sal ha promosso i livelli di espressione delle proteine pro-apoptotiche, Bax, Bim, caspasi scissa-9/7/3 e dei loro geni corrispondenti. Coerentemente, l’intervento di Sal ha ridotto in modo prominente l’espressione delle proteine Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α e FoxO1 e dei loro geni corrispondenti. In conclusione, Sal può essere utilizzato come potenziale composto derivato da erbe per il trattamento del cancro al seno, in quanto può ridurre la proliferazione maligna, la migrazione e l’invasione delle cellule MCF-7 inibendo la via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introduction

Essendo uno dei tumori più comunemente diagnosticati e delle neoplasie maligne più comuni, le ultime statistiche indicano che 2,3 milioni di casi di cancro al seno sono emersi in tutto il mondo entro il 2020, pari all’11,7% di tutti i casi di cancro1. I sintomi comuni del cancro al seno includono tensione mammaria e formicolio, noduli e dolore al seno, secrezione dal capezzolo, erosione o pelle infossata e linfonodi ascellari ingrossati 1,2. Ancora più allarmante, il numero di nuovi casi e l’incidenza complessiva del cancro al seno continuano ad aumentare a un ritmo schiacciante ogni anno, rappresentando il 6,9%dei decessi correlati al cancro. Attualmente, l’intervento per il cancro al seno prevede ancora principalmente chemioterapia, chirurgia, radioterapia e trattamento completo. Sebbene il trattamento possa ridurre efficacemente il tasso di recidiva e il tasso di mortalità dei pazienti, l’applicazione del trattamento a lungo termine spesso causa resistenza multifarmaco, perdita di capelli su vasta area, nausea e vomito e grave carico mentale e psicologico 2,3. In particolare, il potenziale rischio di metastasi multiple d’organo da cancro al seno costringe anche le persone a cercare nuove fonti erboristiche di terapia farmacologica 4,5.

La segnalazione mediata dalla fosfoinositide 3 chinasi (PI3K) è implicata nella crescita, nella proliferazione e nella sopravvivenza del carcinoma mammario attraverso lo splicing che influenza l’espressione di più geni6. Come proteina di rilevamento del segnale a valle di PI3K, numerose evidenze suggeriscono che la proteina chinasi B (AKT) potrebbe accoppiarsi con il bersaglio dei mammiferi della proteina rapamicina (mTOR) per aumentare ulteriormente il cancro al seno 7,8,9. Inoltre, la disattivazione della segnalazione PI3K/AKT/mTOR è stata anche ritenuta una componente chiave nei farmaci che inibiscono la proliferazione maligna e stimolano l’apoptosi nel carcinoma mammario10,11,12. È ben noto che l’ipossia estrema nel microambiente tumorale costringe a un massiccio aumento del fattore 1 alfa inducibile dall’ipossia (HIF-1α), che peggiora ulteriormente la progressione del cancro al seno13,14,15. Parallelamente, la stimolazione AKT porta anche a un eccessivo accumulo di HIF-1α, limitando l’apoptosi nei campioni di cancro al seno16,17. È interessante notare che è stato confermato che l’attivazione della segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α è coinvolta nella progressione patologica e nelle metastasi in una varietà di tumori, tra cui il cancro del polmone18, il cancro del colon-retto19, il cancro ovarico20 e il cancro alla prostata21. Oltre ad essere orchestrata da HIF-1α, la sovraespressione del fattore di trascrizione della testa biforcuta 1 (FoxO1) è anche innescata dalla stimolazione della segnalazione AKT, che promuove l’arresto del ciclo e l’inibizione dell’apoptosi nelle cellule di cancro al seno22,23. Insieme, le solide evidenze di cui sopra suggeriscono che l’inibizione della cascata di segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 può essere un potenziale nuovo bersaglio per la terapia farmacologica nel carcinoma mammario.

È stato ampiamente dimostrato che il salidroside (Sal) esercita attività antitumorali24,25, anti-ipossia26,27,28,29 e immuno-potenzianti30. È una polvere marrone chiaro o marrone facilmente solubile in acqua, è un tipo di glicoside feniletanoide e ha una formula di struttura chimica di C14H 20 O7 e un peso molecolare di300.331,32. Moderne indagini farmacologiche hanno dimostrato che Sal può promuovere l’apoptosi delle cellule tumorali gastriche limitando la segnalazione PI3K-AKT-mTOR24. Ulteriori evidenze suggeriscono anche che la soppressione della segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α da parte del trattamento con Sal può contribuire all’apoptosi delle cellule tumorali aumentando la loro sensibilità agli agenti chemioterapici25. L’evidenza suggerisce anche che Sal limita la migrazione e l’invasione cellulare e provoca l’arresto del ciclo promuovendo l’apoptosi nelle cellule MCF-7 del cancro al seno umano33,34. Tuttavia, resta da vedere se Sal può regolare la segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 e inibire la proliferazione maligna delle cellule MCF-7. Pertanto, questo protocollo mirava a esplorare gli effetti di Sal sulla migrazione, l’invasione, il ciclo cellulare e l’apoptosi delle cellule MCF-7 attraverso la via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Le strategie di ricerca integrate che comprendono esperimenti convenzionali, a basso costo e indipendenti, come le valutazioni della migrazione e dell’invasione cellulare, l’apoptosi e il rilevamento del ciclo cellulare mediante citometria a flusso, le specie reattive dell’ossigeno (ROS) e la determinazione della fluorescenza Ca2+, ecc., possono fornire un riferimento per la progettazione complessiva di esperimenti per la ricerca anti-cancro con la medicina erboristica tradizionale. Il processo sperimentale di questo studio è mostrato nella Figura 1.

Protocol

Le cellule MCF-7 utilizzate per il presente studio sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi la Tabella dei Materiali). 1. Colture cellulari Coltura delle cellule MCF-7 in un’atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 37 °C con DMEM contenente il 10% di FBS e l’1% di penicillina (10.000 U/mL)/streptomicina (10.000 μg/mL) (vedere la tabella dei materiali).NOTA: Le cellule che coprono il 90% del fondo del piatto son…

Representative Results

Effetti del Sal sull’inibizione dell’eccesso di proliferazione e sul ritardo della guarigione delle ferite nelle cellule MCF-7Per sondare il potenziale di Sal contro il cancro al seno, abbiamo prima testato le sue proprietà antitumorali utilizzando la tossicità della proliferazione cellulare e i saggi di graffio della linea cellulare MCF-7 del cancro al seno umano. Queste cellule sono state co-incubate con una serie di concentrazioni di Sal (5-320 μM) per 24 ore e la proliferazione cellulare è st…

Discussion

Il cancro al seno colpisce individui di tutte le età e provoca un carico fisico e mentale incalcolabile e una grande pressione economica1. Il cancro al seno, con la sua morbilità e mortalità che aumentano ogni anno, ha anche attirato l’attenzione mondiale in termini di ricerca di terapie composte efficaci a base di erbe al di là dei trattamenti convenzionali 4,5. Promettentemente, un ampio corpo di prove ha rivelato gli effetti antitum…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione sanitaria della provincia di Sichuan (120025).

Materials

1% penicillin/streptomycin HyClone SV30010
AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT0185
Annexin V-FITC/PI kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. AP101
Automatic microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
Bax antibody Cell Signaling Technology, Inc. #5023
BCA kit Biosharp Life Sciences BL521A
Bcl-2 antibody Cell Signaling Technology, Inc. #15071
Bim antibody Cell Signaling Technology, Inc. #2933
Ca2+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-4-2
Cell counting kit-8 Biosharp Life Sciences BS350B
Cell cycle staining kit MultiSciences Biotech Co., Ltd. CCS012
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technology, Inc. #9661
cleaved caspase-7 Cell Signaling Technology, Inc. #8438
cleaved caspase-9 Cell Signaling Technology, Inc. #20750
Crystal violet solution Beyotime Biotechnology C0121
DMEM high glucose culture medium Servicebio Technology Co., Ltd. G4510
Doxorubicin hydrochloride MedChemExpress HY-15142
ECL chemiluminescent solution Biosharp Life Sciences BL520B
Fetal bovine serum Procell Life Science & Technology Co., Ltd. 164210
Flow cytometer BD FACSCanto Equation 1
Fluo-4 AM Beyotime Biotechnology S1060
FoxO1 antibody ImmunoWay Biotechnology Company YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody MultiSciences Biotech Co., Ltd. 70-GAR0072
GraphPad Prism software La Jolla Version 6.0
HIF-1α antibody Affinity Biosciences BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7 Procell Life Science & Technology Co., Ltd. CL-0149
Loading buffer Biosharp Life Sciences BL502B
LY294002 MedChemExpress HY-10108
Matrigel Thermo  356234
mTOR antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A070-2-2
Optical microscope Olympus IX71PH
p-AKT antibody ImmunoWay Biotechnology Company YP0006
PI3K antibody Servicebio Technology Co., Ltd. GB11525
p-PI3K antibody Affinity Biosciences AF3241
Quantitative western blot imaging system Touch Image Pro eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit Servicebio Technology Co., Ltd. G3330-100
ROS assay kit Beyotime Biotechnology S0033S DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside Chengdu Herbpurify Co., Ltd. H-040
SDS-PAGE kit Servicebio Technology Co., Ltd. G2003-50T
Total RNA isolation kit Foregene RE-03014
Trypsin HyClone SH30042.01
β-actin Affinity Biosciences AF7018
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References

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Keywords: SalidrosideMCF-7 CellsBreast CancerPI3K/AKT/HIF-1α/FoxO1 SignalingProliferationMigrationInvasionApoptosisCell CycleROSCa2+Na+-K+-ATPaseCa2+-ATPase
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Cui, L., Ye, C., Luo, T., Jiang, H., Lai, B., Wang, H., Chen, Z., Li, Y. Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration. J. Vis. Exp. (196), e65634, doi:10.3791/65634 (2023).
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