Protokollen viser gentagne cerebrospinalvæske og blodsamlinger fra epileptiske rotter udført parallelt med kontinuerlig video-elektroencefalogram (EEG) overvågning. Disse er medvirkende til at udforske mulige forbindelser mellem ændringer i forskellige kropsvæskemolekyler og anfaldsaktivitet.
Fordi sammensætningen af kropsvæsker afspejler mange fysiologiske og patologiske dynamikker, opnås biologiske væskeprøver almindeligvis i mange eksperimentelle sammenhænge for at måle molekyler af interesse, såsom hormoner, vækstfaktorer, proteiner eller små ikke-kodende RNA’er. Et specifikt eksempel er prøveudtagning af biologiske væsker i forskningen af biomarkører for epilepsi. I disse undersøgelser er det ønskeligt at sammenligne niveauerne af molekyler i cerebrospinalvæske (CSF) og plasma ved at trække CSF og plasma parallelt og overveje prøvetagningens tidsafstand fra og til anfald. Den kombinerede CSF og plasmaprøvetagning kombineret med video-EEG-overvågning i epileptiske dyr er en lovende tilgang til validering af formodede diagnostiske og prognostiske biomarkører. Her beskrives en procedure med kombineret CSF-tilbagetrækning fra cisterna magna og blodprøvetagning fra den laterale halevene hos epileptiske rotter, der kontinuerligt overvåges video-EEG. Denne procedure giver betydelige fordele i forhold til andre almindeligt anvendte teknikker. Det tillader hurtig prøveudtagning med minimal smerte eller invasivitet og reduceret anæstesitid. Derudover kan det bruges til at opnå CSF- og plasmaprøver i både tøjrede og telemetri EEG-registrerede rotter, og det kan bruges gentagne gange på tværs af flere dages eksperiment. Ved at minimere stress på grund af prøvetagning ved at forkorte isofluranæstesi forventes foranstaltningerne mere nøjagtigt at afspejle de sande niveauer af undersøgte molekyler i biofluider. Afhængigt af tilgængeligheden af et passende analytisk assay kan denne teknik anvendes til at måle niveauerne af flere forskellige molekyler, mens EEG-registrering udføres på samme tid.
Cerebrospinalvæske (CSF) og blodprøvetagning er vigtige for at identificere og validere biomarkører for epilepsi i både præklinisk og klinisk forskning 1,2. I dag fokuserer diagnosen epilepsi og det meste af forskningen på epilepsibiomarkører på EEG og neuroimaging 3,4,5. Disse tilgange har imidlertid flere begrænsninger. Bortset fra rutinemæssige hovedbundsmålinger kræver EEG i mange tilfælde invasive teknikker som dybdeelektroder6. Hjernebilleddannelsesmetoder har dårlig tidsmæssig og rumlig opløsning og er relativt dyre og tidskrævende 7,8. Af denne grund ville identifikation af ikke-invasive, billige og biofluidbaserede biomarkører være et meget attraktivt alternativ. Derudover kan disse biofluid biomarkører kombineres med tilgængelige diagnostiske tilgange for at skærpe deres forudsigelighed.
Patienter diagnosticeret med epilepsi indsendes rutinemæssigt til EEG 9,10 og blodprøvetagning 11,12,13,14, og mange også til CSF-tilbagetrækning for at udelukke livstruende årsager (dvs. akutte infektioner, autoimmun encephalitis)15. Disse blod- og CSF-prøver kan bruges i klinisk forskning, der sigter mod at identificere biomarkører for epilepsi. For eksempel har Hogg og kolleger fundet ud af, at en stigning i tre plasma tRNA-fragmenter går forud for anfaldsforekomst i human epilepsi14. Tilsvarende kan interleukin-1beta (IL-1β) niveauer i human CSF og serum, udtrykt som forholdet mellem IL-1β niveauer i CSF over serum, forudsige posttraumatisk epilepsiudvikling efter traumatisk hjerneskade16. Disse undersøgelser fremhæver vigtigheden af prøveudtagning af biofluider til forskning i epilepsibiomarkører, men de står over for flere begrænsninger, der er iboende for kliniske forsøg, f.eks. den medstiftende faktor for antiepileptiske lægemidler (AED’er) i blod, den hyppige mangel på ætiologiinformation, utilstrækkelig kontrol, beskedent antal patienter og andre 17,18.
Præklinisk forskning giver andre muligheder for at undersøge molekyler i biofluider som potentielle biomarkører for epilepsi. Faktisk er det muligt at trække plasma og / eller CSF fra dyr, mens du udfører EEG-optagelser. Desuden kan prøveudtagning udføres gentagne gange over flere dage af eksperimentet, og en række alders-, køns- og epileptiske fornærmelsesmatchede kontroller kan bruges til at forbedre undersøgelsens robusthed. Her beskrives en fleksibel teknik til opnåelse af CSF fra cisterna magna med parallel tilbagetrækning af plasma fra halevenen hos EEG-overvågede rotter detaljeret. Den præsenterede teknik har flere fordele i forhold til alternative metoder. Ved at bruge en sommerfuglenålstilgang er det muligt at indsamle CSF flere gange uden at gå på kompromis med funktionen af EEG-elektroder eller lignende hovedimplantater. Dette repræsenterer en forfining af intratekale kateterudtagningsprocedurer, som er forbundet med en relativt høj infektionsrisiko. Derudover er den rapporterede fritfaldsmetode, der anvendes til blodindsamling, bedre end andre tilgange til tilbagetrækning af haleveneblod på grund af den stærkt reducerede risiko for hæmolyse på grund af det faktum, at blod ikke passerer gennem slanger, og der ikke påføres vakuumtryk. Hvis det udføres under strenge bakteriefrie forhold, er der en særlig lav risiko for infektion for dyr. Derudover kan prøveudtagningen gentages flere gange ved at starte blodudtagningerne i slutningen af dyrenes haler. Sådanne teknikker er lette at mestre og kan anvendes i mange prækliniske undersøgelser af lidelser i centralnervesystemet.
Dette arbejde illustrerer en let at mestre teknik til CSF og blodindsamling hos rotter, som kan være nyttig ikke kun til undersøgelser i modeller af epilepsi, men også af andre neurologiske tilstande eller sygdomme som Alzheimer, Parkinson eller multipel sklerose. I epilepsiforskning er begge prøveudtagningsprocedurer kombineret med video-EEG ideelle, når en sammenhæng mellem niveauerne af forskellige opløselige molekyler og anfaldsaktivitet forfølges. Af denne specifikke grund blev der anvendt en kontinuerlig vi…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af et tilskud fra Den Europæiske Unions Horizon 2020-arbejdsprogram (indkaldelse af forslag H2020-FETOPEN-2018-2020) i henhold til tilskudsaftale 964712 (PRIME; til M. Simonato).
Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |