Campionamento del liquido cerebrospinale e del sangue dalla vena caudale laterale nei ratti durante le registrazioni EEG
Summary
Il protocollo mostra ripetute raccolte di liquido cerebrospinale e sangue da ratti epilettici eseguite in parallelo con il monitoraggio continuo del video-elettroencefalogramma (EEG). Questi sono fondamentali per esplorare i possibili collegamenti tra i cambiamenti in varie molecole del fluido corporeo e l’attività convulsiva.
Abstract
Poiché la composizione dei fluidi corporei riflette molte dinamiche fisiologiche e patologiche, i campioni di liquidi biologici sono comunemente ottenuti in molti contesti sperimentali per misurare molecole di interesse, come ormoni, fattori di crescita, proteine o piccoli RNA non codificanti. Un esempio specifico è il campionamento di liquidi biologici nella ricerca di biomarcatori per l’epilessia. In questi studi, è auspicabile confrontare i livelli di molecole nel liquido cerebrospinale (CSF) e nel plasma, prelevando CSF e plasma in parallelo e considerando la distanza temporale del prelievo da e verso le convulsioni. Il campionamento combinato del liquido cerebrospinale e del plasma, abbinato al monitoraggio video-EEG negli animali epilettici, è un approccio promettente per la convalida di potenziali biomarcatori diagnostici e prognostici. Qui viene descritta una procedura di prelievo combinato di liquido cerebrospinale dalla cisterna magna e prelievo di sangue dalla vena caudale laterale nei ratti epilettici che sono continuamente monitorati tramite video-EEG. Questa procedura offre vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche comunemente utilizzate. Consente un campionamento rapido con dolore o invasività minimi e tempi di anestesia ridotti. Inoltre, può essere utilizzato per ottenere campioni di liquido cerebrospinale e plasma in ratti registrati EEG sia legati che telemetrici e può essere utilizzato ripetutamente per più giorni di esperimento. Riducendo al minimo lo stress dovuto al campionamento accorciando l’anestesia con isoflurano, ci si aspetta che le misure riflettano in modo più accurato i livelli reali delle molecole indagate nei biofluidi. A seconda della disponibilità di un test analitico appropriato, questa tecnica può essere utilizzata per misurare i livelli di molecole multiple e diverse eseguendo contemporaneamente la registrazione EEG.
Introduction
Il liquido cerebrospinale (CSF) e il prelievo di sangue sono importanti per identificare e convalidare i biomarcatori dell’epilessia, sia nella ricerca preclinica che in quella clinica 1,2. Al giorno d’oggi, la diagnosi di epilessia e la maggior parte della ricerca sui biomarcatori dell’epilessia si concentrano sull’EEG e sul neuroimaging 3,4,5. Questi approcci, tuttavia, presentano diverse limitazioni. Oltre alle misurazioni di routine del cuoio capelluto, in molti casi, l’EEG richiede tecniche invasive come gli elettrodi di profondità6. I metodi di imaging cerebrale hanno una scarsa risoluzione temporale e spaziale e sono relativamente costosi e dispendiosi in termini di tempo 7,8. Per questo motivo, l’identificazione di biomarcatori non invasivi, a basso costo e basati su biofluidi fornirebbe un’alternativa molto interessante. Inoltre, questi biomarcatori di biofluidi potrebbero essere combinati con gli approcci diagnostici disponibili per affinare la loro predittività.
I pazienti con diagnosi di epilessia vengono regolarmente sottoposti all’EEG 9,10 e al prelievo di sangue 11,12,13,14, e molti anche al prelievo di liquido cerebrospinale per escludere cause potenzialmente letali (ad esempio, infezioni acute, encefalite autoimmune)15. Questi campioni di sangue e liquor possono essere utilizzati nella ricerca clinica volta a identificare i biomarcatori per l’epilessia. Ad esempio, Hogg e collaboratori hanno scoperto che un aumento di tre frammenti plasmatici di tRNA precede l’insorgenza di convulsioni nell’epilessia umana14. Allo stesso modo, i livelli di interleuchina-1beta (IL-1β) nel liquido cerebrospinale umano e nel siero, espressi come rapporto tra i livelli di IL-1β nel liquido cerebrospinale rispetto al siero, possono predire lo sviluppo di epilessia post-traumatica dopo una lesione cerebrale traumatica16. Questi studi evidenziano l’importanza del campionamento dei biofluidi per la ricerca sui biomarcatori dell’epilessia, ma si scontrano con molteplici limitazioni intrinseche agli studi clinici, ad esempio, il fattore cofondatore dei farmaci antiepilettici (AED) nel sangue, la frequente mancanza di informazioni eziologiche, controlli inadeguati, un numero modesto di pazienti e altri17,18.
La ricerca preclinica offre altre opportunità per studiare le molecole nei biofluidi come potenziali biomarcatori per l’epilessia. Infatti, è possibile prelevare plasma e/o liquido cerebrospinale dagli animali durante l’esecuzione di registrazioni EEG. Inoltre, il campionamento può essere eseguito ripetutamente per più giorni dell’esperimento e un certo numero di controlli abbinati per età, sesso e insulti epilettici possono essere utilizzati per migliorare la robustezza dello studio. Qui, viene descritta in dettaglio una tecnica flessibile per ottenere CSF dalla cisterna magna con prelievo parallelo di plasma dalla vena caudale nei ratti monitorati con EEG. La tecnica presentata presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi. Utilizzando un approccio con ago a farfalla, è possibile raccogliere più volte il liquido cerebrospinale senza compromettere la funzione degli elettrodi EEG o di impianti di testa simili. Ciò rappresenta un perfezionamento delle procedure di prelievo del catetere intratecale, che sono associate a un rischio relativamente elevato di infezione. Inoltre, l’approccio di caduta libera utilizzato per la raccolta del sangue è superiore ad altri approcci di prelievo di sangue della vena caudale a causa del rischio altamente ridotto di emolisi, dovuto al fatto che il sangue non passa attraverso i tubi e non viene applicata alcuna pressione di vuoto. Se eseguito in condizioni rigorose di assenza di germi, il rischio di infezione per gli animali è particolarmente basso. Inoltre, avviando i prelievi di sangue all’estremità della coda degli animali, il prelievo può essere ripetuto più volte. Tali tecniche sono facili da padroneggiare e possono essere applicate in molti studi preclinici sui disturbi del sistema nervoso centrale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente lavoro illustra una tecnica di raccolta del liquido cerebrospinale e del sangue nei ratti, che può essere utile non solo per studi in modelli di epilessia ma anche di altre condizioni o malattie neurologiche come l’Alzheimer, il Parkinson o la sclerosi multipla. Nella ricerca sull’epilessia, entrambe le procedure di campionamento abbinate al video-EEG sono ideali quando viene perseguita una correlazione tra i livelli di diverse molecole solubili e l’attività convulsiva. Per questo specifico motivo, è stata…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del programma di lavoro Horizon 2020 dell’Unione Europea (call H2020-FETOPEN-2018-2020) nell’ambito dell’accordo di sovvenzione 964712 (PRIME; a M. Simonato).
Materials
| Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
| Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
| Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
| Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
| Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
| Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
| Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
| Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
| Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
| Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
| Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
| Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
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