הדפסה ביולוגית תלת-ממדית הידרוג'לים פוטו-ממדיים לחקר הפעלת פיברובלסטים
Summary
מאמר זה מתאר כיצד להדפיס ביו-ממד הידרוג’לים פוטו-ממדיים כדי לחקור התקשות מטריצה חוץ-תאית והפעלת פיברובלסטים.
Abstract
הידרוג’לים שאינם ניתנים לצילום יכולים להשתנות מרחבית וזמנית בתגובה לחשיפה לאור. שילוב סוגים אלה של ביו-חומרים בפלטפורמות של תרביות תאים והפעלת שינויים באופן דינמי, כגון הגברת הנוקשות המיקרו-סביבתית, מאפשר לחוקרים למדל שינויים במטריצה החוץ תאית (ECM) המתרחשים במהלך התקדמות המחלה הפיברוטית (Fibrotic). כאן מוצגת שיטה להדפסה ביולוגית תלת-ממדית של ביו-חומר הידרוג’ל המסוגל לבצע שתי תגובות פילמור רציפות בתוך אמבט תמיכה בג’לטין. הטכניקה של הטבעה הפיכה חופשית של הידרוג’לים מרחפים (FRESH) הותאמה על ידי התאמת ה- pH של אמבט התמיכה כדי להקל על תגובת תוספת מיכאל. ראשית, הביו-דיו המכיל פולי(אתילן גליקול)-אלפא מתקרילט (PEGαMA) הגיב מחוץ לסטויכיומטריה עם קרוסלינקר מתכלה לתאים ליצירת הידרוג’לים רכים. הידרוג’לים רכים אלה נחשפו מאוחר יותר לפוטואינטטור ולאור כדי לגרום להומופולימריזציה של קבוצות לא מגיבות ולהקשיח את ההידרוג’ל. פרוטוקול זה מכסה סינתזת הידרוג’ל, הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, פוטו-הקשחה ואפיון נקודות קצה להערכת הפעלת פיברובלסטים בתוך מבנים תלת-ממדיים. השיטה המוצגת כאן מאפשרת לחוקרים להדפיס ביו-ממד בתלת-ממד מגוון חומרים העוברים תגובות פילמור המזורזות ב-pH וניתן ליישם אותם כדי להנדס מודלים שונים של הומאוסטזיס רקמות, מחלות ותיקון.
Introduction
הדפסה ביולוגית תלת-ממדית היא טכנולוגיה טרנספורמטיבית המאפשרת לחוקרים להפקיד במדויק תאים וביו-חומרים בנפחים תלת-ממדיים וליצור מחדש את המבנה ההיררכי המורכב של רקמות ביולוגיות. במהלך העשור האחרון, ההתקדמות בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית יצרה רקמות לב אנושיות פועמות1, מודלים פונקציונליים של רקמות כליות2, מודלים של חילופי גזים בתוך הריאה3, ומודלים של גידולים לחקר הסרטן4. המצאת טכניקות הדפסה ביולוגית תלת-ממדיות משובצות, כגון הטבעה הפיכה חופשית של הידרוג’ל מרחף (FRESH), אפשרה לשחזר מבנים מורכבים של רקמות רכות כגון כלי דם ריאתיים5 ואפילו לב אנושי6 בתלת-ממד. הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של FRESH מאפשרת הדפסה שכבה אחר שכבה של דיו ביולוגי רך ובעל צמיגות נמוכה באמצעות אקסטרוזיה לתוך אמבט תמיכה דליל גזירה. אמבט התמיכה מורכב מחומר כגון מיקרו-חלקיקי ג’לטין ארוזים היטב הפועלים כפלסטיק בינגהאם ושומרים על הצורה והמבנה המיועדים של הביו-דיו לאחר ההדפסה. לאחר שהמבנה המודפס התמצק, ניתן להמיס את אמבט התמיכה על ידי העלאת הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס7.
מאמר סקירה שפורסם לאחרונה סיכם את החומרים שהודפסו בתלת-ממד בפרסומים שונים בטכניקת FRESH. חומרים טבעיים אלה נעים בין קולגן מסוג I לחומצה היאלורונית מתקרילט ומייצגים מספר מנגנוני ג’לציה שונים7. רוב המחקרים המבוצעים בטכניקת הדפסה ביולוגית תלת-ממדית זו משתמשים בביו-חומרים סטטיים שאינם משתנים בתגובה לגירויים חיצוניים. ביו-חומרים הידרוג’ל דינמיים פוטו-פוטו-ג’ל שימשו את המעבדה שלנו ואחרים 8,9,10,11,12 כדי למדל מגוון מחלות פיברוטיות. שלא כמו ביו-חומרים סטטיים, דיו ביולוגי המותאם לשימוש באור מאפשר ליצור מודל מרוכך עם ערך מודולוס אלסטי נמוך יותר, ולאחר מכן להקשיח אותו כדי לחקור תגובות תאיות לעלייה בהתקשות מיקרו-סביבתית.
מחלות פיברוטיות מאופיינות בעלייה בייצור המטריצה החוץ תאית שעלולה לגרום להצטלקות והתקשות13. התקשות רקמות יכולה ליזום פגיעה נוספת והרס של הרקמה הפגועה, גרימת נזק קבוע לאיברים ואפילו מוות; הפרעות פיברוטיות אחראיות לשליש מהתמותה בעולם. פיברובלסטים מייצרים מטריצה חוץ-תאית עודפת וחריגה במצב מחלה זה14,15. התפשטות פיברובלסטים מוגברת ושקיעת מטריצה חוץ-תאית מקשיחים עוד יותר את הרקמה ומפעילים לולאת משוב חיובי פרופיברוטית16,17,18,19. חקר הפעלת פיברובלסטים חיוני להבנת מחלות פיברוטיות. כאן אנו מציגים יתר לחץ דם עורקי ריאתי אנושי (PAH) כדוגמה להפרעה פיברוטית אחת שבה חשוב לחקות את הגיאומטריה התלת-ממדית של כלי הדם באמצעות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית ולהציג את יכולות ההתקשות הדינמיות של הידרוג’לים פוטו-ממדיים. PAH הוא מצב שבו הלחץ בעורקי הריאה הראשיים עולה על רמות נורמליות ומפעיל עומס על הלב, מגביר את הפעלת הפיברובלסט ההרפתקני של עורק הריאה האנושי (HPAAF) ומקשיח את רקמות כלי הדם16,17,18,19. נוסחת ביודיו פולי(אתילן גליקול)-אלפא מתקרילט (PEGαMA) מאפשרת התקשות טמפורלית במבנים ומסייעת למדל הן רקמות בריאות והן התקדמות מחלה 5,8,9,10. ניצול תכונה ייחודית זו מאפשר לכמת את ההפעלה וההתרבות של HPAAF בתגובה להתקשות מיקרו-סביבתית בתלת-ממד ועשוי לספק תובנה רבת ערך לגבי המנגנונים התאיים המעורבים במחלה זו. הפרוטוקול המתואר כאן יאפשר לחוקרים ליצור מודלים תלת-ממדיים המשחזרים שינויים במיקרו-סביבה החוץ תאית במהלך התקדמות המחלה או תיקון רקמות ולחקור הפעלת פיברובלסטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תגובות פילמור דו-שלביות בתגובה לחשיפה מבוקרת לאור יכולות להקשיח ביו-חומרים באמצעות בקרה מרחבית וזמנית. מספר מחקרים רתמו טכניקה זו להערכת אינטראקציות תא-מטריצה בפלטפורמות שונות 5,8,9,10,11,21,22,23.<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לד”ר אדם פיינברג (אוניברסיטת קרנגי מלון) ולאלה שאירחו את סדנת הקוד הפתוח להדפסה ביולוגית בתלת ממד. אנשים אלה אפשרו ללמוד את הטכניקות של הדפסה ביולוגית של FRESH ולבנות את המדפסת הביולוגית התלת-ממדית המשמשת למחקרים אלה. בנוסף, המחברים מבקשים להכיר Biorender.com, אשר שימש ליצירת דמויות בכתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי מספר קבוצות או מקורות מימון, כולל קרן קהילת רוז (DDH ו- CMM), פרס מחקר מחלות כלי דם ריאתיים בקולורדו (DDH ו- CMM), הקרן הלאומית למדע תחת פרס 1941401 (CMM), מחלקת הצבא תחת פרס W81XWH-20-1-0037 (CMM), המכון הלאומי לסרטן של NIH תחת פרס R21 CA252172 (CMM), מרכז משפחת לודמן לחקר בריאות האישה בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ (DDH ו- CMM), המכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרסים R01 HL080396 (CMM), R01 HL153096 (CMM), F31 HL151122 (DDH) ו- T32 HL072738 (DDH ו- AT).
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
References
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
- Lin, N. Y. C., et al. Renal reabsorption in 3D vascularized proximal tubule models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5399-5404 (2019).
- Grigoryan, B., et al. Multivascular networks and functional intravascular topologies within biocompatible hydrogels. Science. 364 (6439), 458-464 (2019).
- Kang, Y., Datta, P., Shanmughapriya, S., Ozbolat, I. T. 3D bioprinting of tumor models for cancer research. ACS Applied Biomaterials. 3 (9), 5552-5573 (2020).
- Davis-Hall, D., Thomas, E., Pena, B., Magin, C. M. 3D-bioprinted, phototunable hydrogel models for studying adventitial fibroblast activation in pulmonary arterial hypertension. Biofabrication. 15 (1), (2022).
- Mirdamadi, E., Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Palchesko, R. N., Feinberg, A. W. FRESH 3D bioprinting of a full-size model of the human heart. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (11), 6453-6459 (2020).
- Shiwarski, D. J., Hudson, A. R., Tashman, J. W., Feinberg, A. W. Emergence of FRESH 3D printing as a platform for advanced tissue biofabrication. APL Bioengineering. 5 (1), 010904 (2021).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Hewawasam, R. S., Blomberg, R., Serbedzija, P., Magin, C. M. Chemical modification of human decellularized extracellular matrix for incorporation into phototunable hybrid hydrogel models of tissue fibrosis. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (12), 15071-15083 (2023).
- Saleh, K. S., et al. Engineering hybrid hydrogels comprised healthy or diseased decellularized extracellular matrix to study pulmonary fibrosis. Cellular and Molecular Bioengineering. 15 (5), 505-519 (2022).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Stiffening hydrogels to probe short- and long-term cellular responses to dynamic mechanics. Nature Communications. 3, 792 (2012).
- Rosales, A. M., Vega, S. L., DelRio, F. W., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Hydrogels with reversible mechanics to probe dynamic cell microenvironments. Angewandte Chemie International Edition English. 56 (40), 12132-12136 (2017).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nature Medicine. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Huertas, A., Tu, L., Humbert, M., Guignabert, C. Chronic inflammation within the vascular wall in pulmonary arterial hypertension: more than a spectator. Cardiovascular Research. 116 (5), 885-893 (2020).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. The Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
- Habiel, D. M., Hogaboam, C. Heterogeneity in fibroblast proliferation and survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 5, 2 (2014).
- Hu, C. J., Zhang, H., Laux, A., Pullamsetti, S. S., Stenmark, K. R. Mechanisms contributing to persistently activated cell phenotypes in pulmonary hypertension. The Journal of Physiology. 597 (4), 1103-1119 (2019).
- Li, M., et al. Emergence of fibroblasts with a proinflammatory epigenetically altered phenotype in severe hypoxic pulmonary hypertension. The Journal of Immunology. 187 (5), 2711-2722 (2011).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform-reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Brown, T. E., et al. Secondary photocrosslinking of click hydrogels to probe myoblast mechanotransduction in three dimensions. Journal of the American Chemical Society. 140 (37), 11585-11588 (2018).
- Ondeck, M. G., et al. Dynamically stiffened matrix promotes malignant transformation of mammary epithelial cells via collective mechanical signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3502-3507 (2019).
- Caliari, S. R., et al. Stiffening hydrogels for investigating the dynamics of hepatic stellate cell mechanotransduction during myofibroblast activation. Scientific Reports. 6, 21387 (2016).
- Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. Journal of Cell Biology. 190 (4), 693-706 (2010).
- Tschumperlin, D. J., Ligresti, G., Hilscher, M. B., Shah, V. H. Mechanosensing and fibrosis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 74-84 (2018).
- Chelladurai, P., Seeger, W., Pullamsetti, S. S. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in pulmonary hypertension. European Respiratory Journal. 40 (3), 766-782 (2012).
- Caracena, T., et al. Alveolar epithelial cells and microenvironmental stiffness synergistically drive fibroblast activation in three-dimensional hydrogel lung models. Biomaterials Science. 10 (24), 7133-7148 (2022).
- Ruskowitz, E. R., DeForest, C. A. Proteome-wide analysis of cellular response to ultraviolet light for biomaterial synthesis and modification. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (5), 2111-2116 (2019).
- Kruse, C. R., et al. The effect of pH on cell viability, cell migration, cell proliferation, wound closure, and wound reepithelialization: In vitro and in vivo study. Wound Repair and Regeneration. 25 (2), 260-269 (2017).
- Filippi, M., et al. Perfusable biohybrid designs for bioprinted skeletal muscle tissue. Advanced Healthcare Materials. , e1500758 (2023).
- Matthiesen, I., et al. Astrocyte 3D culture and bioprinting using peptide-functionalized hyaluronan hydrogels. Science and Technology of Advanced Materials. 24 (1), 2165871 (2023).
- Xu, L., et al. Bioprinting a skin patch with dual-crosslinked gelatin (GelMA) and silk fibroin (SilMA): An approach to accelerating cutaneous wound healing. Materials Today Bio. 18, 100550 (2023).
- Bliley, J. M., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. 3D-bioprinted human tissue and the path toward clinical translation. Science Translational Medicine. 14 (666), eabo7047 (2022).
