섬유아세포 활성화를 연구하기 위한 3D 바이오프린팅 광조정 가능 하이드로겔
Summary
이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.
Abstract
광조정 가능한 하이드로겔은 빛 노출에 반응하여 공간적, 시간적으로 변형될 수 있습니다. 이러한 유형의 생체 재료를 세포 배양 플랫폼에 통합하고 미세환경 강성 증가와 같은 변화를 동적으로 유발함으로써 연구자들은 섬유화 질환 진행 중에 발생하는 세포외 기질(ECM)의 변화를 모델링할 수 있습니다. 여기에서, 젤라틴 지지 수조 내에서 2개의 순차적 중합 반응이 가능한 광조정 가능한 하이드로겔 생체 재료를 3D 바이오프린팅하기 위한 방법이 제시된다. 부유 하이드로겔의 자유형 가역적 임베딩(FRESH) 바이오프린팅 기술은 마이클 첨가 반응을 촉진하기 위해 지지 수조의 pH를 조정하여 조정되었습니다. 먼저, 폴리(에틸렌글리콜)-알파메타크릴레이트(PEGαMA)를 함유하는 바이오잉크를 세포분해성 가교제와 화학량론적으로 반응시켜 연질 하이드로겔을 형성하였다. 이 연질 하이드로겔은 나중에 광자극제와 빛에 노출되어 미반응기의 동질중합을 유도하고 하이드로겔을 경화시켰습니다. 이 프로토콜은 하이드로겔 합성, 3D 바이오프린팅, 광보강 및 3D 구조 내에서 섬유아세포 활성화를 평가하기 위한 종말점 특성 분석을 다룹니다. 여기에 제시된 방법을 통해 연구자들은 pH 촉매 중합 반응을 겪는 다양한 물질을 3D 바이오프린팅할 수 있으며 조직 항상성, 질병 및 복구의 다양한 모델을 엔지니어링하는 데 구현할 수 있습니다.
Introduction
3D 바이오프린팅은 연구자들이 3D 부피 내에 세포와 생체 재료를 정밀하게 증착하고 생체 조직의 복잡한 계층 구조를 재현할 수 있도록 하는 혁신적인 기술입니다. 지난 10년 동안 3D 바이오프린팅의 발전으로 박동하는 인간 심장 조직1, 신장 조직의 기능적 모델2, 폐 내 가스 교환 모델3, 암 연구를 위한 종양 모델4이 개발되었다. FRESH(Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel) 바이오프린팅과 같은 임베디드 3D 바이오프린팅 기술의 발명으로 폐 혈관(pulmonary blood vessel)5 및 심지어 인간의 심장( human heart)6 과 같은 복잡한 연조직 구조를 3D로 재현할 수 있게 되었습니다. FRESH 3D 바이오프린팅은 전단 담화 지지 수조로의 압출을 통해 부드러운 바이오잉크와 저점도 바이오잉크의 층별 프린팅을 용이하게 합니다. 서포트 수조는 Bingham 플라스틱 역할을 하고 인쇄 후 바이오잉크의 의도된 모양과 구조를 유지하는 밀접하게 포장된 젤라틴 미세 입자와 같은 재료로 구성됩니다. 인쇄된 구조체가 응고되면, 온도를 37°C7로 높여서 지지 수조를 용해시킬 수 있다.
최근 리뷰 기사는 FRESH 기술을 사용하여 다양한 출판물에서 3D 바이오프린팅된 재료를 요약했습니다. 이러한 천연 유래 물질은 콜라겐 유형 I에서 메타크릴레이트 히알루론산에 이르기까지 다양하며 여러 가지 겔화 메커니즘을 나타냅니다7. 이 3D 바이오프린팅 기술을 사용하여 수행된 대부분의 연구는 외부 자극에 반응하여 변하지 않는 정적 생체 재료를 사용합니다. 동적 광화 하이드로겔 생체 재료는 다양한 섬유화 질환을 모델링하기 위해 우리 연구실 및 기타 8,9,10,11,12에서 사용되었습니다. 정적 생체 재료와 달리 광조정 가능 바이오잉크를 사용하면 탄성 계수 값이 낮은 연화 모델을 생성하고 나중에 경질하여 미세 환경 경직 증가에 대한 세포 반응을 탐색할 수 있습니다.
섬유화 질환은 흉터와 경직을 유발할 수 있는 세포외 기질 생성의 증가를 특징으로 한다13. 조직 경직은 영향을 받은 조직의 추가 손상과 파괴를 시작하여 영구적인 장기 손상과 심지어 사망을 유발할 수 있습니다. 섬유화 질환은 전 세계 사망의 1/3을 차지합니다. 섬유아세포는 이 질병 상태에서 과잉 및 비정상적인 세포외 기질을 생성한다14,15. 증가된 섬유아세포 증식 및 세포외 기질 침착은 조직을 더욱 단단하게 하고 섬유화 양성 피드백 루프(profibrotic positive feedback loop)를 활성화시킨다16,17,18,19. 섬유아세포 활성화를 연구하는 것은 섬유화 질환을 이해하는 데 매우 중요합니다. 여기서는 3D 바이오프린팅을 사용하여 혈관의 3D 형상을 모방하는 것이 중요한 한 가지 섬유화 질환의 예로 인간 폐동맥 고혈압(PAH)을 제시하고 광조정 가능 하이드로겔의 동적 경화 기능을 소개합니다. PAH는 주요 폐동맥의 압력이 정상 수준을 초과하여 심장에 부담을 가하여 인간 폐동맥 외래 섬유아세포(HPAAF) 활성화를 증가시키고 혈관 조직을 경직시키는 상태입니다16,17,18,19. 광조정 가능한 폴리(에틸렌 글리콜)-알파 메타크릴레이트(PEGαMA) 바이오잉크 제형은 구조물의 시간적 경화를 허용하고 건강한 조직과 질병 진행을 모두 모델링하는 데 도움이 됩니다 5,8,9,10. 이 고유한 기능을 활용하면 미세환경 경화에 대한 반응으로 HPAAF 활성화 및 증식을 3D로 정량화할 수 있으며 이 질병과 관련된 세포 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜을 통해 연구자들은 질병 진행 또는 조직 복구 중 세포 외 미세환경의 변화를 요약하는 3D 모델을 만들고 섬유아세포 활성화를 연구할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제어된 빛 노출에 대한 반응으로 2단계 중합 반응은 공간적 및 시간적 제어를 통해 생체 재료를 강화할 수 있습니다. 여러 연구에서 이 기술을 활용하여 다양한 플랫폼 5,8,9,10,11,21,22,23에서 세포-매트릭스 상호작용을 평가했습니다.<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Adam Feinberg 박사(카네기 멜론 대학교)와 3D 바이오프린팅 오픈 소스 워크숍을 주최한 사람들에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 사람들은 FRESH 바이오프린팅 기술을 배우고 이러한 연구에 사용되는 3D 바이오프린터를 구축할 수 있었습니다. 덧붙여, 저자들은 이 원고에서 인물을 생산하는 데 사용된 Biorender.com 인정하고 싶다. 이 연구는 Rose Community Foundation(DDH 및 CMM), Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award(DDH 및 CMM), Award 1941401(CMM)의 National Science Foundation, Award W81XWH-20-1-0037(CMM)의 미 육군부, Award R21 CA252172(CMM)의 NIH 국립 암 연구소, University of Colorado Anschutz Medical Campus의 Ludeman Family Center for Women’s Health Research(DDH 및 CMM), R01 HL080396(CMM), R01 HL153096(CMM), F31 HL151122(DDH) 및 T32 HL072738(DDH 및 AT).
Materials
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
| Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
| Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
| Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
| Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
| 8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
| 365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
| Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
| Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
| Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
| 50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
| Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
| 15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
| 30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
| Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
| Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
| Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
| MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
| 20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
| 200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
| 1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
| Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
| Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
| Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
| Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
| RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Rocker | VWR | 10127-876 | |
| Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
| Rubber Band | Staples | 808659 | |
| Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
| Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
| Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
| Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
| Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
| Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
| Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
| T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
| Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
| Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
| Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
| Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
| Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
| 24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
References
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