Platform til kvantitativ påvisning af endometrieimmunceller baseret på immunhistokemi og digital billedanalyse

Summary

Her blev en digital immunhistokemisk billedanalyseplatform udviklet og valideret til kvantitativt at analysere endometrieimmuncellerne hos patienter med tilbagevendende aborter i implantationsvinduet.

Abstract

For at evaluere endometrieimmunmikromiljøet hos patienter med tilbagevendende abort (RM) blev en digital immunhistokemisk billedanalyseplatform udviklet og valideret til kvantitativt at analysere endometrieimmunceller i midtlutealfasen. Alle endometriumprøver blev indsamlet i den midterste luteale fase af menstruationscyklussen. Paraffinindlejrede endometrievæv blev sektioneret i 4 μm tykke dias, og immunohistokemi (IHC) farvning blev udført til påvisning af endometrieimmunceller, herunder CD56 + uNK-celler, Foxp3 + Tregs, CD163 + M2 makrofager, CD1a + DC’er og CD8 + T-celler. De panoramiske dias blev scannet ved hjælp af en digital diasscanner, og et kommercielt billedanalysesystem blev brugt til kvantitativ analyse. Procentdelen af endometrieimmunceller blev beregnet ved at dividere antallet af immunceller i de samlede endometrieceller. Ved hjælp af det kommercielle billedanalysesystem kunne kvantitativ evaluering af endometrieimmunceller, som er vanskelige eller umulige at analysere med konventionel billedanalyse, let og nøjagtigt analyseres. Denne metode kan anvendes til kvantitativt at karakterisere endometriummikromiljøet, herunder interaktion mellem immunceller og dets heterogenitet for forskellige patienter med reproduktionssvigt. Platformen for kvantitativ evaluering af endometrieimmunceller kan være af vigtig klinisk betydning for diagnosticering og behandling af RM-patienter.

Introduction

Tilbagevendende abort (RM) er tabet af to eller flere på hinanden følgende graviditeter og er en kompleks sygdom, der tiltrækker opmærksomhed fra klinikere i de senere år. Incidensraten for RM hos kvinder i den fødedygtige alder er 1%-5% ¹. Resultaterne af tidligere undersøgelser viser, at immunfaktorer er tæt forbundet med patogenesen af RM 2,3,4,5. Opretholdelse af immunhomeostase ved moder-føtal interface er nødvendig for embryoimplantation og udvikling. Endometrieimmune celler udfører flere regulerende roller for at opretholde denne homeostase, såsom at fremme trofoblastinvasion, ombygning af spiralarterier og bidrage til placentaudvikling 6,7,8,9.

Afvigende endometrieimmunceller hos kvinder med RM er tidligere blevet rapporteret. Resultaterne viser en tæt sammenhæng mellem den høje tæthed af livmoderens naturlige dræberceller (uNK’er) og forekomsten af RM^10,11,12. Et øget antal makrofager er blevet rapporteret i endometrium af kvinder med RM, sammenlignet med dem, der havde en levende fødsel¹³. Regulatoriske T-celler (Treg) spiller en rolle i moderens immuntolerance over for embryoet, og deres niveau og funktion reduceres i RM-patienters decidua¹⁴. Cytotoksicitet T-celler (CTL) og dendritiske celler (DC’er) spiller også en rolle i immunreguleringen af graviditet^15,16. Derfor kan en omfattende kvantitativ analyse af lokale endometrieimmunceller i midten af lutealfasen bidrage til bedre at forstå patogenesen af RM. Nogle nuværende metoder til kvantitativ analyse af endometrieimmunceller bruger flowcytometri, som nøjagtigt kan mærke immunceller med flere markører^17,18. Imidlertid er klinisk anvendelse af flowcytometri begrænset, fordi den kun kan udføres på frisk væv. Opnåelse af frisk væv er kun muligt, når et stort volumen overskydende tumor er tilgængelig, en sjælden forekomst for endometrium. Immunohistokemi kan observere vævsmorfologi godt in situ og kan også mærke forskellige immunceller, mens traditionelle immunhistokemiske teknikker ikke kan udføre kvantitativ analyse af immunceller.

Sammenlignet med konventionelle immunhistokemiske eksperimenter har kvantitativ immunohistokemisk analyse af immunceller i endometrium vigtig klinisk betydning. IHC-intensitetsscore rangeres normalt på en firepunktsskala eller stærk og svag i patologisk diagnostik og forskning 19,20,21. Denne semikvantitative teknik er imidlertid subjektiv, meget unøjagtig og viser betydelig variation inden for observatøren og mellem observatørerne²². En mulig løsning er anvendelsen af maskinlæring, som er værdifuld idigital billedanalyse^23,24. Ved at tilvejebringe kvantitative målinger muliggør denne tilgang en mere præcis vurdering af immuncelleinfiltration, distribution og densitet i livmodervævet. Disse kvantitative oplysninger kan bidrage til at belyse de dynamiske ændringer i immuncellepopulationer under menstruationscyklussen og under forskellige patologiske tilstande. Samlet set giver evnen til kvantitativt at analysere immunceller i endometrium gennem immunhistokemi værdifuld indsigt i livmoderens immunmikromiljø.

Derfor havde protokollen til formål at udvikle og validere en digital immunhistokemisk billedanalyseplatform til kvantitativt at analysere endometrieimmunceller, herunder uNK-celler, Tregs, makrofager, DC’er og cytotoksiske T-celler i midtlutealfasen hos RM-patienter.

Protocol

Forskningsindholdet og protokollen er blevet etisk gennemgået og godkendt af den forskningsetiske komité på Shenzhen Zhongshan Urology Hospital. Alle kvinder (20-40 år), der var involveret i undersøgelsen, gav informeret samtykke til prøveindsamling og brug. 1. Erhvervelse af patologisk væv Forbered værktøjerne til vævshøstning, nemlig måling af lineal, pincet, indlejringskassette, indlejringspapir og vævskurv. Overhold om mængden af endometri…

Representative Results

For at evaluere endometrieimmunceller kvantitativt og reducere ustabiliteten forårsaget af menneskeskabte driftsfejl etablerede vi en digital kvantitativ analyseplatform for endometrieimmunceller ved hjælp af automatisk immunhistokemisk detektion og digitalt kvantitativt evalueringssystem. Immunohistokemisk billedanalyseplatform blev etableret til kvantitativt at analysere endometrieimmunceller hos patienter med tilbagevendende abort (RM) i implantationsvinduet. Alle endometriumvæv blev indsamlet i midten af lutealfas…

Discussion

Denne protokol etablerede en digital immunhistokemisk billedanalyseplatform til kvantitativt at analysere endometrieimmunceller hos RM-patienter. Her blev seks endometrieimmunmarkører påvist for at evaluere endometrieimmunmikromiljøet hos RM-patienter.

Et modtageligt endometrium i midten af lutealfasen er nøglen til vellykket implantation og graviditet^27,28. Derfor spiller evaluering af procent endometrieimmunceller en vigtig rolle…

Materials

Automated coverslipper	Sakuraus	DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163	GrowGn Biotechnology	NCL-L-CD163
CD1a	Gene Tech	GM357129
CD56	Gene Tech	GT200529
CD8	Novocastra	NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator	Thermo Fisher	Excelsior ES
Digital pathology and	Indica labs	HALO
Foxp3	YILIFANG biological	14-477-82
IHC stainer	Leica	BOND III
Image analysis platform	Indica labs	HALO
Slide Scanner	Olympus life science	VS200