Platform voor kwantitatieve detectie van endometriumimmuuncellen op basis van immunohistochemie en digitale beeldanalyse
Summary
Hier werd een digitaal immunohistochemisch beeldanalyseplatform ontwikkeld en gevalideerd om de endometriumimmuuncellen van patiënten met terugkerende miskramen in het implantatievenster kwantitatief te analyseren.
Abstract
Om de endometrium-immuunmicro-omgeving van patiënten met recidiverende miskramen (RM) te evalueren, werd een digitaal immunohistochemisch beeldanalyseplatform ontwikkeld en gevalideerd om endometrium-immuuncellen kwantitatief te analyseren tijdens de mid-luteale fase. Alle endometriummonsters werden verzameld tijdens de mid-luteale fase van de menstruatiecyclus. In paraffine ingebedde endometriumweefsels werden in 4 μm dikke objectglaasjes verdeeld en immunohistochemie (IHC)-kleuring werd uitgevoerd voor het detecteren van endometriumimmuuncellen, waaronder CD56+ uNK-cellen, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2-macrofagen, CD1a+ DC’s en CD8+ T-cellen. De panoramische dia’s werden gescand met behulp van een digitale diascanner en voor kwantitatieve analyse werd een commercieel beeldanalysesysteem gebruikt. Het percentage endometrium-immuuncellen werd berekend door het aantal immuuncellen in de totale endometriumcellen te delen. Met behulp van het commerciële beeldanalysesysteem kan kwantitatieve evaluatie van endometriumimmuuncellen, die moeilijk of onmogelijk te analyseren zijn met conventionele beeldanalyse, gemakkelijk en nauwkeurig worden geanalyseerd. Deze methodologie kan worden toegepast om de micro-omgeving van het baarmoederslijmvlies, inclusief interactie tussen immuuncellen, en de heterogeniteit ervan voor verschillende patiënten met reproductief falen kwantitatief te karakteriseren. Het platform voor kwantitatieve evaluatie van endometriumimmuuncellen kan van belangrijke klinische betekenis zijn voor de diagnose en behandeling van RM-patiënten.
Introduction
Terugkerende miskraam (RM) is het verlies van twee of meer opeenvolgende zwangerschappen en is een complexe ziekte die de afgelopen jaren de aandacht van clinici heeft getrokken. De incidentie van RM bij vrouwen in de vruchtbare leeftijd is 1%-5% 1. Resultaten van eerdere studies tonen aan dat immuunfactoren nauw samenhangen met de pathogenese van RM 2,3,4,5. Het handhaven van de immuunhomeostase op het raakvlak tussen moeder en foetus is vereist voor de implantatie en ontwikkeling van embryo’s. Endometriumimmuuncellen vervullen verschillende regulerende rollen om deze homeostase te behouden, zoals het bevorderen van trofoblastinvasie, het hermodelleren van spiraalvormige slagaders en het bijdragen aan de ontwikkeling van de placenta 6,7,8,9.
Afwijkende endometrium-immuuncellen bij vrouwen met RM zijn eerder gemeld. De resultaten tonen een nauw verband aan tussen de hoge dichtheid van natuurlijke killercellen van de baarmoeder (uNK’s) en het voorkomen van RM10,11,12. Er is een verhoogd aantal macrofagen gemeld in het baarmoederslijmvlies van vrouwen met RM, vergeleken met degenen die een levendgeborene hadden13. Regulerende T-cellen (Treg) spelen een rol bij de immuuntolerantie van de moeder ten opzichte van het embryo, en hun niveau en functie zijn verminderd in de decidua van RM-patiënten14. Cytotoxiciteit T-cellen (CTL) en dendritische cellen (DC’s) spelen ook een rol bij de immuunregulatie van zwangerschap15,16. Daarom zou een uitgebreide kwantitatieve analyse van lokale endometriumimmuuncellen tijdens de mid-luteale fase kunnen helpen om de pathogenese van RM beter te begrijpen. Sommige huidige methoden voor kwantitatieve analyse van endometrium-immuuncellen maken gebruik van flowcytometrie die immuuncellen nauwkeurig kan labelen met meerdere markers17,18. De klinische toepassing van flowcytometrie is echter beperkt omdat deze alleen op vers weefsel kan worden uitgevoerd. Het verkrijgen van vers weefsel is alleen haalbaar als er een groot volume overtollige tumor beschikbaar is, een zeldzaam verschijnsel voor baarmoederslijmvlies. Immunohistochemie kan weefselmorfologie goed in situ observeren en kan ook verschillende immuuncellen labelen, terwijl traditionele immunohistochemische technieken geen kwantitatieve analyse van immuuncellen kunnen uitvoeren.
In vergelijking met conventionele immunohistochemische experimenten heeft kwantitatieve immunohistochemische analyse van immuuncellen in het baarmoederslijmvlies een belangrijke klinische betekenis. IHC-intensiteitsscores worden meestal gerangschikt op een vierpuntsschaal of sterk en zwak in pathologische diagnostiek en onderzoek 19,20,21. Deze semi-kwantitatieve techniek is echter subjectief, zeer onnauwkeurig en vertoont een significante variabiliteit binnen en tussen waarnemers22. Een mogelijke oplossing is de toepassing van machine learning, wat waardevol is indigitale beeldanalyse23,24. Door kwantitatieve metingen te leveren, maakt deze benadering een nauwkeurigere beoordeling mogelijk van de infiltratie, distributie en dichtheid van immuuncellen in het baarmoederweefsel. Deze kwantitatieve informatie kan helpen bij het ophelderen van de dynamische veranderingen in immuuncelpopulaties tijdens de menstruatiecyclus en in verschillende pathologische aandoeningen. Over het algemeen biedt het vermogen om immuuncellen in het baarmoederslijmvlies kwantitatief te analyseren door middel van immunohistochemie waardevolle inzichten in de immuunmicro-omgeving van de baarmoeder.
Daarom was het protocol gericht op het ontwikkelen en valideren van een digitaal immunohistochemisch beeldanalyseplatform om endometrium-immuuncellen, waaronder uNK-cellen, Tregs, macrofagen, DC’s en cytotoxische T-cellen, kwantitatief te analyseren tijdens de mid-luteale fase bij RM-patiënten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol heeft een digitaal immunohistochemisch beeldanalyseplatform opgezet om endometrium-immuuncellen van RM-patiënten kwantitatief te analyseren. Hier werden zes endometrium-immuunmarkers gedetecteerd om de endometrium-immuunmicro-omgeving bij RM-patiënten te evalueren.
Een receptief baarmoederslijmvlies tijdens de mid-luteale fase is de sleutel tot succesvolle implantatie en zwangerschap27,28. Daarom speelt de evaluatie van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dankbaar voor alle vrouwen die toestemming hebben gegeven en monsters hebben gedoneerd voor deze studie.
Materials
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
References
- Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
- Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. Recurrent pregnancy loss. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).
- Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
- Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
- Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
- Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
- Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
- Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
- Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
- Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
- Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
- Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
- Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
- Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).
- Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
- Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).
- Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
- Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).
- Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
- Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
- Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
- Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
- Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
- Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
- Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
- Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
- Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
- Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
- O’Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).
- Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).
