इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और डिजिटल छवि विश्लेषण के आधार पर एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मात्रात्मक पहचान के लिए मंच
Summary
यहां, एक डिजिटल इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण मंच विकसित किया गया था और आरोपण की खिड़की में आवर्तक गर्भपात वाले रोगियों के एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए मान्य किया गया था।
Abstract
आवर्तक गर्भपात (आरएम) वाले रोगियों के एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट का मूल्यांकन करने के लिए, एक डिजिटल इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण मंच विकसित किया गया था और मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए मान्य किया गया था। मासिक धर्म चक्र के मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान सभी एंडोमेट्रियम नमूने एकत्र किए गए थे। पैराफिन-एम्बेडेड एंडोमेट्रियल ऊतकों को 4 माइक्रोन मोटी स्लाइड में विभाजित किया गया था, और सीडी 56 + यूएनके कोशिकाओं, फॉक्सपी 3 + ट्रेग्स, सीडी 163 + एम 2 मैक्रोफेज, सीडी 1 ए + डीसी, और सीडी 8 + टी कोशिकाओं सहित एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) धुंधला हो गया था। पैनोरमिक स्लाइड्स को डिजिटल स्लाइड स्कैनर का उपयोग करके स्कैन किया गया था और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक वाणिज्यिक छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग किया गया था। एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना कुल एंडोमेट्रियल कोशिकाओं में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके की गई थी। वाणिज्यिक छवि विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करना, एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक मूल्यांकन, जो पारंपरिक छवि विश्लेषण के साथ विश्लेषण करना मुश्किल या असंभव है, आसानी से और सटीक विश्लेषण किया जा सकता है। इस पद्धति को एंडोमेट्रियम माइक्रोएन्वायरमेंट को मात्रात्मक रूप से चिह्नित करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत और विभिन्न प्रजनन विफलता रोगियों के लिए इसकी विषमता शामिल है। एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए मंच आरएम रोगियों के निदान और उपचार के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक महत्व का हो सकता है।
Introduction
आवर्तक गर्भपात (आरएम) दो या दो से अधिक लगातार गर्भधारण का नुकसान है और हाल के वर्षों में चिकित्सकों का ध्यान आकर्षित करने वाली एक जटिल बीमारी है। प्रसव उम्र की महिलाओं में आरएम की घटना दर 1% -5% है 1. पिछले अध्ययनों के परिणाम बताते हैं कि प्रतिरक्षा कारक आरएम 2,3,4,5 के रोगजनन के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं। भ्रूण आरोपण और विकास के लिए मातृ-भ्रूण इंटरफ़ेस पर प्रतिरक्षा होमियोस्टेसिस बनाए रखना आवश्यक है। एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाएं इस होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए कई नियामक भूमिकाएं करती हैं, जैसे कि ट्रोफोब्लास्ट आक्रमण को बढ़ावा देना, सर्पिल धमनियों को फिर से तैयार करना और प्लेसेंटा विकास 6,7,8,9 में योगदान देना।
आरएम के साथ महिलाओं में असामान्य एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं को पहले रिपोर्ट किया गया है। परिणाम गर्भाशय प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (यूएनके) के उच्च घनत्व और आरएम10,11,12 की घटना के बीच घनिष्ठ संबंध दिखाते हैं। मैक्रोफेज की एक वृद्धि हुई संख्या आरएम के साथ महिलाओं के एंडोमेट्रियम में सूचित किया गया है, जो एक जीवित जन्मथा 13 की तुलना में. नियामक टी कोशिकाओं (Treg) भ्रूण की ओर मातृ प्रतिरक्षा सहिष्णुता में एक भूमिका निभाते हैं, और उनके स्तर और समारोह आरएम रोगियों14 के decidua में कमी आई है. साइटोटॉक्सिसिटी टी कोशिकाओं (सीटीएल) और वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) भी गर्भावस्था15,16 की प्रतिरक्षा विनियमन में एक भूमिका निभाते हैं. इसलिए, मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान स्थानीय एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक व्यापक मात्रात्मक विश्लेषण आरएम के रोगजनन को बेहतर ढंग से समझने में मदद कर सकता है। एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कुछ मौजूदा तरीकों प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करें जो कई मार्करों17,18 के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं को सटीक रूप से लेबल कर सकते हैं। हालांकि, प्रवाह साइटोमेट्री का नैदानिक अनुप्रयोग सीमित है क्योंकि यह केवल ताजा ऊतक पर किया जा सकता है। ताजा ऊतक प्राप्त करना केवल तभी संभव है जब अतिरिक्त ट्यूमर की एक बड़ी मात्रा उपलब्ध हो, एंडोमेट्रियम के लिए एक दुर्लभ घटना। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ऊतक आकृति विज्ञान को सीटू में अच्छी तरह से देख सकती है और विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भी लेबल कर सकती है, जबकि पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल तकनीक प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण नहीं कर सकती है।
पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रयोगों की तुलना में, एंडोमेट्रियम में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के मात्रात्मक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण का महत्वपूर्ण नैदानिक महत्व है। आईएचसी तीव्रता स्कोरिंग आमतौर पर एक चार बिंदु पैमाने पर या मजबूत और पैथोलॉजिकल निदान और अनुसंधान 19,20,21 में कमजोर पर रैंक किया जाता है. हालांकि, इस अर्द्ध मात्रात्मक तकनीक व्यक्तिपरक, अत्यधिक गलत है, और महत्वपूर्ण इंट्रा पर्यवेक्षक और अंतर-पर्यवेक्षक परिवर्तनशीलता22 प्रदर्शित करता है. एक संभावित समाधान मशीन सीखने का अनुप्रयोग है, जो मूल्यवान हैडिजिटल छवि विश्लेषण23,24. मात्रात्मक माप प्रदान करके, यह दृष्टिकोण गर्भाशय के ऊतकों के भीतर प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ, वितरण और घनत्व का अधिक सटीक मूल्यांकन सक्षम बनाता है। यह मात्रात्मक जानकारी मासिक धर्म चक्र के दौरान और विभिन्न रोग स्थितियों में प्रतिरक्षा कोशिका आबादी में गतिशील परिवर्तनों को स्पष्ट करने में मदद कर सकती है। कुल मिलाकर, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के माध्यम से एंडोमेट्रियम में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण करने की क्षमता गर्भाशय के प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।
इसलिए, प्रोटोकॉल का उद्देश्य आरएम रोगियों में मध्य-ल्यूटियल चरण के दौरान यूएनके कोशिकाओं, ट्रेग्स, मैक्रोफेज, डीसी और साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं सहित एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए एक डिजिटल इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण मंच को विकसित और मान्य करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल ने आरएम रोगियों के एंडोमेट्रियल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए एक डिजिटल इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि विश्लेषण मंच स्थापित किया। यहां, आरएम रोगियों में एंडोमे…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक उन सभी महिलाओं के आभारी हैं जिन्होंने इस अध्ययन के लिए सहमति दी और नमूने दान किए।
Materials
| Automated coverslipper | Sakuraus | DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2 | |
| CD163 | GrowGn Biotechnology | NCL-L-CD163 | |
| CD1a | Gene Tech | GM357129 | |
| CD56 | Gene Tech | GT200529 | |
| CD8 | Novocastra | NCL-L-CD8-4B11 | |
| Dehydrator | Thermo Fisher | Excelsior ES | |
| Digital pathology and | Indica labs | HALO | |
| Foxp3 | YILIFANG biological | 14-477-82 | |
| IHC stainer | Leica | BOND III | |
| Image analysis platform | Indica labs | HALO | |
| Slide Scanner | Olympus life science | VS200 |
References
- Practice Committee of the American Society for Reproductive. Evaluation and treatment of recurrent pregnancy loss: a committee opinion. Fertility and Sterility. 98 (5), 1103-1111 (2012).
- Dimitriadis, E., Menkhorst, E., Saito, S., Kutteh, W. H., Brosens, J. J. Recurrent pregnancy loss. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 98 (2020).
- Kavvadas, D., et al. Immunohistochemical Evaluation of CD3, CD4, CD8, and CD20 in Decidual and Trophoblastic Tissue Specimens of Patients with Recurrent Pregnancy Loss. 12 (2), 177-193 (2022).
- Arora, R., Rathee, A., Sachdeva, M., Agrawal, U. Unexplained repeated pregnancy loss and T helper cells. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 254, 277-283 (2020).
- Du, M., et al. Elevated percentage of CD3(+)T cells and pregnancy outcome in women with recurrent pregnancy loss. Clinica Chimica Acta. 486, 341-346 (2018).
- Faas, M. M., de Vos, P. Uterine NK cells and macrophages in pregnancy. Placenta. 56, 44-52 (2017).
- Huppertz, B., Berghold, V. M., Kawaguchi, R., Gauster, M. A variety of opportunities for immune interactions during trophoblast development and invasion. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (5), 349-357 (2012).
- Meyer, N., et al. Chymase-producing cells of the innate immune system are required for decidual vascular remodeling and fetal growth. Scientific Reports. 7, 45106 (2017).
- Smith, S. D., Dunk, C. E., Aplin, J. D., Harris, L. K., Jones, R. L. Evidence for immune cell involvement in decidual spiral arteriole remodeling in early human pregnancy. American Journal of Pathology. 174 (5), 1959-1971 (2009).
- Clifford, K., Flanagan, A. M., Regan, L. Endometrial CD56+ natural killer cells in women with recurrent miscarriage: a histomorphometric study. Human Reproduction. 14 (11), 2727-2730 (1999).
- Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 217 (6), 680 e1-680 e6 (2017).
- Tuckerman, E., Mariee, N., Prakash, A., Li, T. C., Laird, S. Uterine natural killer cells in peri-implantation endometrium from women with repeated implantation failure after IVF. Journal of Reproductive Immunology. 87 (1-2), 60-66 (2010).
- Laird, S. M., et al. A review of immune cells and molecules in women with recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 9 (2), 163-174 (2003).
- Keller, C. C., Eikmans, M., van der Hoorn, M. P., Lashley, L. Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review. Journal of Reproductive Immunology. 139, 103105 (2020).
- Vallvé-Juanico, J., Houshdaran, S., Giudice, L. C. The endometrial immune environment of women with endometriosis. Human Reproduction Update. 25 (5), 564-591 (2019).
- Yang, F., Zheng, Q., Jin, L. Dynamic Function and Composition Changes of Immune Cells During Normal and Pathological Pregnancy at the Maternal-Fetal Interface. Frontiers in Immunology. 10, 2317 (2019).
- Hey-Cunningham, A. J., et al. Comprehensive analysis utilizing flow cytometry and immunohistochemistry reveals inflammatory changes in local endometrial and systemic dendritic cell populations in endometriosis. Human Reproduction. 36 (2), 415-428 (2021).
- Zhong, Q., et al. Patterns of Immune Infiltration in Endometriosis and Their Relationship to r-AFS Stages. Frontiers in Genetics. 12, 631715 (2021).
- Attems, J., et al. Neuropathological consensus criteria for the evaluation of Lewy pathology in post-mortem brains: a multi-centre study. Acta Neuropathologic. 141 (2), 159-172 (2021).
- Kovacs, G. G., et al. Multisite Assessment of Aging-Related Tau Astrogliopathy (ARTAG). Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 76 (7), 605-619 (2017).
- Modis, L. V., et al. Extracellular matrix changes in corneal opacification vary depending on etiology. Molecular Vision. 27, 26-36 (2021).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Jensen, K., Krusenstjerna-Hafstrom, R., Lohse, J., Petersen, K. H., Derand, H. A novel quantitative immunohistochemistry method for precise protein measurements directly in formalin-fixed, paraffin-embedded specimens: analytical performance measuring HER2. Modern Pathology. 30 (2), 180-193 (2017).
- Moreno-Ruiz, P., Wik Leiss, L., Mezheyeuski, A., Ehnman, M. Double Immunohistochemistry and Digital Image Analysis. Methods in Molecular Biology. 1913, 3-11 (2019).
- Li, D., Zheng, L., Zhao, D., Xu, Y., Wang, Y. The Role of Immune Cells in Recurrent Spontaneous Abortion. Reproductive Sciences. 28 (12), 3303-3315 (2021).
- Diao, L., et al. New endometrial immune cell-based score (EI-score) for the prediction of implantation success for patients undergoing IVF/ICSI. Placenta. 99, 180-188 (2020).
- Hewitt, S. C., Korach, K. S. Cell biology. A hand to support the implantation window. Science. 331 (6019), 863-864 (2011).
- Afshar, Y., Stanculescu, A., Miele, L., Fazleabas, A. T. The role of chorionic gonadotropin and Notch1 in implantation. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 24 (7), 296-302 (2007).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Communication (London,England). 40 (4), 135-153 (2020).
- Algars, A., et al. Type and location of tumor-infiltrating macrophages and lymphatic vessels predict survival of colorectal cancer patients. International Journal of Cancer. 131 (4), 864-873 (2012).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
- Ascierto, M. L., et al. Transcriptional Mechanisms of Resistance to Anti-PD-1 Therapy. Clinical Cancer Research. 23 (12), 3168-3180 (2017).
- O’Rourke, D. M., et al. A single dose of peripherally infused EGFRvIII-directed CAR T cells mediates antigen loss and induces adaptive resistance in patients with recurrent glioblastoma. Science Translational Medicine. 9 (399), eaaa0984 (2017).
- Canesin, G., et al. Treatment with the WNT5A-mimicking peptide Foxy-5 effectively reduces the metastatic spread of WNT5A-low prostate cancer cells in an orthotopic mouse model. PLoS One. 12 (9), e0184418 (2017).
