Plattform for kvantitativ deteksjon av immunceller i endometrier basert på immunhistokjemi og digital bildeanalyse

Summary

Her ble en digital immunohistokjemi bildeanalyseplattform utviklet og validert for å kvantitativt analysere endometrieimmunceller hos pasienter med tilbakevendende spontanaborter i implantasjonsvinduet.

Abstract

For å evaluere immunmikromiljøet til pasienter med tilbakevendende abort (RM), ble en digital immunhistokjemi bildeanalyseplattform utviklet og validert for kvantitativt å analysere endometrieimmunceller i midten av lutealfasen. Alle endometriumprøver ble samlet inn i midten av lutealfasen av menstruasjonssyklusen. Parafininnebygd endometrievev ble seksjonert i 4 μm tykke lysbilder, og immunhistokjemi (IHC)farging ble utført for å oppdage endometrieimmunceller, inkludert CD56+ uNK-celler, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2-makrofager, CD1a+ DC-er og CD8+ T-celler. Panoramalysbildene ble skannet ved hjelp av en digital lysbildeskanner og et kommersielt bildeanalysesystem ble brukt til kvantitativ analyse. Prosentandelen av endometrieimmunceller ble beregnet ved å dele antall immunceller i de totale endometriecellene. Ved hjelp av det kommersielle bildeanalysesystemet kan kvantitativ evaluering av endometrieimmunceller, som er vanskelige eller umulige å analysere med konvensjonell bildeanalyse, enkelt og nøyaktig analyseres. Denne metoden kan brukes til å kvantitativt karakterisere endometriummikromiljøet, inkludert interaksjon mellom immunceller, og dets heterogenitet for forskjellige pasienter med reproduktiv svikt. Plattformen for kvantitativ evaluering av endometrieimmunceller kan være av viktig klinisk betydning for diagnostikk og behandling av RM-pasienter.

Introduction

Tilbakevendende abort (RM) er tap av to eller flere påfølgende graviditeter og er en kompleks sykdom som trekker oppmerksomhet fra klinikere de siste årene. Forekomsten av RM hos kvinner i fertil alder er 1% -5% ¹. Resultater fra tidligere studier viser at immunfaktorer er nært forbundet med patogenesen av RM 2,3,4,5. Opprettholde immunhomeostase ved mor-føtalgrensesnittet er nødvendig for embryoimplantasjon og utvikling. Endometrial immunceller utfører flere regulatoriske roller for å opprettholde denne homeostasen, for eksempel å fremme trofoblastinvasjon, omforme spiralarterier og bidra til placentautvikling 6,7,8,9.

Avvikende endometrieimmunceller hos kvinner med RM er tidligere rapportert. Resultatene viser en nær sammenheng mellom den høye tettheten av livmor naturlige drepeceller (uNK) og forekomsten av RM^10,11,12. Et økt antall makrofager er rapportert i endometrium hos kvinner med RM, sammenlignet med de som hadde en levende fødsel¹³. Regulatoriske T-celler (Treg) spiller en rolle i mors immuntoleranse mot embryoet, og deres nivå og funksjon reduseres i decidua hos RM-pasienter¹⁴. Cytotoksisitet T-celler (CTL) og dendrittiske celler (DC) spiller også en rolle i immunreguleringen av graviditet^15,16. Derfor kan en omfattende kvantitativ analyse av lokale endometrieimmunceller i midt-lutealfasen bidra til å bedre forstå patogenesen av RM. Noen nåværende metoder for kvantitativ analyse av endometrieimmunceller bruker flowcytometri som nøyaktig kan merke immunceller med flere markører^17,18. Klinisk anvendelse av flowcytometri er imidlertid begrenset fordi den kun kan utføres på ferskt vev. Innhenting av ferskt vev er bare mulig når et stort volum overflødig tumor er tilgjengelig, en sjelden forekomst for endometrium. Immunhistokjemi kan observere vevsmorfologi godt in situ og kan også merke ulike immunceller, mens tradisjonelle immunhistokjemiske teknikker ikke kan utføre kvantitativ analyse av immunceller.

Sammenlignet med konvensjonelle immunhistokjemiske eksperimenter har kvantitativ immunhistokjemisk analyse av immunceller i endometrium viktig klinisk betydning. IHC-intensitetsskåring er vanligvis rangert på en firepunkts skala eller sterk og svak i patologisk diagnostikk og forskning 19,20,21. Imidlertid er denne semi-kvantitative teknikken subjektiv, svært unøyaktig, og demonstrerer betydelig intra-observatør og inter-observatør variabilitet²². En mulig løsning er bruk av maskinlæring, som er verdifull i digital bildeanalyse^23,24. Ved å gi kvantitative målinger, muliggjør denne tilnærmingen en mer presis vurdering av immuncelleinfiltrasjon, distribusjon og tetthet i livmorvevet. Denne kvantitative informasjonen kan bidra til å belyse de dynamiske endringene i immuncellepopulasjoner under menstruasjonssyklusen og i ulike patologiske forhold. Samlet sett gir evnen til kvantitativt å analysere immunceller i endometrium gjennom immunhistokjemi verdifull innsikt i livmorens immunmikromiljø.

Derfor hadde protokollen som mål å utvikle og validere en digital immunhistokjemi bildeanalyseplattform for kvantitativt å analysere endometrieimmunceller, inkludert uNK-celler, Tregs, makrofager, DCs og cytotoksiske T-celler i midtlutealfasen hos RM-pasienter.

Protocol

Forskningsinnholdet og protokollen er etisk gjennomgått og godkjent av forskningsetisk komité ved Shenzhen Zhongshan urologisykehus. Alle kvinner (20-40 år) som var involvert i studien, ga informert samtykke til prøveinnsamling og bruk. 1. Oppkjøp av patologisk vev Forbered verktøyene for vevshøsting, nemlig målelinjal, pinsett, innebyggingskassett, embeddingpapir og vevkurv. Vær oppmerksom på om mengden endometrievev (større enn en mungbønne), …

Representative Results

For å evaluere endometrieimmunceller kvantitativt og redusere ustabiliteten forårsaket av menneskeskapte operasjonsfeil, etablerte vi en digital kvantitativ analyseplattform for endometrieimmunceller ved hjelp av automatisk immunhistokjemisk deteksjon og digitalt kvantitativt evalueringssystem. Immunohistochemistry bildeanalyseplattform ble etablert for å kvantitativt analysere endometrieimmunceller hos pasienter med tilbakevendende abort (RM) i implantasjonsvinduet. Alle endometriumvev ble samlet i midten av lutealfa…

Discussion

Denne protokollen etablerte en digital immunhistokjemi bildeanalyseplattform for kvantitativt å analysere endometrieimmunceller hos RM-pasienter. Her ble seks endometrieimmunmarkører detektert for å evaluere endometrieimmunmikromiljøet hos RM-pasienter.

Et mottakelig endometrium i midten av lutealfasen er nøkkelen til vellykket implantasjon og graviditet^27,28. Derfor spiller evaluering av prosentvise endometrieimmunceller en vikti…

Materials

Automated coverslipper	Sakuraus	DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163	GrowGn Biotechnology	NCL-L-CD163
CD1a	Gene Tech	GM357129
CD56	Gene Tech	GT200529
CD8	Novocastra	NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator	Thermo Fisher	Excelsior ES
Digital pathology and	Indica labs	HALO
Foxp3	YILIFANG biological	14-477-82
IHC stainer	Leica	BOND III
Image analysis platform	Indica labs	HALO
Slide Scanner	Olympus life science	VS200