Платформа для количественного обнаружения иммунных клеток эндометрия на основе иммуногистохимии и анализа цифровых изображений

Summary

Здесь была разработана и валидирована цифровая платформа иммуногистохимического анализа изображений для количественного анализа иммунных клеток эндометрия пациенток с повторяющимися выкидышами в окне имплантации.

Abstract

Для оценки иммунного микроокружения эндометрия пациенток с привычным невынашиванием беременности (РМ) была разработана и валидирована цифровая платформа иммуногистохимического анализа изображений для количественного анализа иммунных клеток эндометрия в середине лютеиновой фазы. Все образцы эндометрия были собраны во время среднелютеиновой фазы менструального цикла. Залитые парафином ткани эндометрия разделяли на предметные стекла толщиной 4 мкм, и проводили иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание для выявления иммунных клеток эндометрия, включая CD56+ мNK-клетки, Foxp3+ Tregs, CD163+ M2-макрофаги, CD1a+ DC и CD8+ Т-клетки. Панорамные слайды сканировались с помощью цифрового сканера слайдов, а для количественного анализа использовалась коммерческая система анализа изображений. Процентное содержание иммунных клеток эндометрия рассчитывали путем деления количества иммунных клеток в общем количестве клеток эндометрия. Используя коммерческую систему анализа изображений, можно легко и точно проанализировать количественную оценку иммунных клеток эндометрия, которые трудно или невозможно проанализировать с помощью обычного анализа изображений. Данная методика может быть применена для количественной характеристики микроокружения эндометрия, в том числе взаимодействия между иммунными клетками, и его гетерогенности у пациентов с различными репродуктивными пороками. Платформа для количественной оценки иммунных клеток эндометрия может иметь важное клиническое значение для диагностики и лечения пациенток с РМ.

Introduction

Привычный выкидыш (РМ) представляет собой потерю двух или более последовательных беременностей и является сложным заболеванием, привлекающим внимание клиницистов в последние годы. Частота РМ у женщин детородного возраста составляет 1%-5%¹. Результаты предыдущих исследований показывают, что иммунные факторы тесно связаны с патогенезом РМ 2,3,4,5. Поддержание иммунного гомеостаза на границе между матерью и плодом необходимо для имплантации и развития эмбриона. Иммунные клетки эндометрия выполняют несколько регуляторных ролей для поддержания этого гомеостаза, таких как стимулирование инвазии трофобласта, ремоделирование спиральных артерий и содействие развитию плаценты 6,7,8,9.

Ранее сообщалось об аберрантных иммунных клетках эндометрия у женщин с РМ. Результаты показывают тесную связь между высокой плотностью маточных естественных киллеров (uNK) и возникновением RM^10,11,12. Сообщалось о повышенном количестве макрофагов в эндометрии женщин с РМ по сравнению с теми, кто родился живым¹³. Регуляторные Т-клетки (Treg) играют роль в материнской иммунной толерантности к эмбриону, и их уровень и функция снижены в децидуа пациентов с РМ¹⁴. Цитотоксичность Т-клеток (ЦТЛ) и дендритных клеток (ДК) также играют роль в иммунной регуляции беременности^15,16. Таким образом, комплексный количественный анализ локальных иммунных клеток эндометрия в середине лютеиновой фазы может помочь лучше понять патогенез РМ. Некоторые современные методы количественного анализа иммунных клеток эндометрия используют проточную цитометрию, которая может точно помечать иммунные клетки несколькими маркерами^17,18. Однако клиническое применение проточной цитометрии ограничено, поскольку она может быть выполнена только на свежих тканях. Получение свежей ткани возможно только при наличии большого объема избыточной опухоли, что является редким явлением для эндометрия. Иммуногистохимия может хорошо наблюдать морфологию тканей in situ, а также может маркировать различные иммунные клетки, в то время как традиционные иммуногистохимические методы не могут выполнять количественный анализ иммунных клеток.

По сравнению с обычными иммуногистохимическими экспериментами, количественный иммуногистохимический анализ иммунных клеток эндометрия имеет важное клиническое значение. Оценка интенсивности ИГХ обычно оценивается по четырехбалльной шкале или по сильной и слабой в патологической диагностике и исследованиях 19,20,21. Однако этот полуколичественный метод является субъективным, крайне неточным и демонстрирует значительную внутринаблюдательную и межнаблюдательную изменчивость²². Одним из возможных решений является применение машинного обучения, которое является ценным в цифровом анализе изображений^23,24. Обеспечивая количественные измерения, этот подход позволяет более точно оценить инфильтрацию, распределение и плотность иммунных клеток в ткани матки. Эта количественная информация может помочь пролить свет на динамические изменения популяций иммунных клеток во время менструального цикла и при различных патологических состояниях. В целом, возможность количественного анализа иммунных клеток эндометрия с помощью иммуногистохимии дает ценную информацию об иммунном микроокружении матки.

Таким образом, протокол был направлен на разработку и валидацию цифровой платформы иммуногистохимического анализа изображений для количественного анализа иммунных клеток эндометрия, включая uNK-клетки, Tregs, макрофаги, ДК и цитотоксические Т-клетки во время средней лютеиновой фазы у пациентов с РМ.

Protocol

Содержание и протокол исследования были этически проверены и одобрены комитетом по этике исследований урологической больницы Шэньчжэнь Чжуншань. Все женщины (в возрасте от 20 до 40 лет), участвовавшие в исследовании, дали информированное согласие на сбор и использование образцов. <p clas…

Representative Results

С целью количественной оценки иммунных клеток эндометрия и снижения нестабильности, вызванной техногенными операционными ошибками, мы создали платформу цифрового количественного анализа иммунных клеток эндометрия с использованием автоматического иммуногистохимического обнаруже?…

Discussion

Этот протокол создал цифровую платформу иммуногистохимического анализа изображений для количественного анализа иммунных клеток эндометрия пациенток с РМ. Здесь было выявлено шесть иммунных маркеров эндометрия для оценки иммунного микроокружения эндометрия у пациенток с РМ.

<p class=…

Materials

Automated coverslipper	Sakuraus	DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163	GrowGn Biotechnology	NCL-L-CD163
CD1a	Gene Tech	GM357129
CD56	Gene Tech	GT200529
CD8	Novocastra	NCL-L-CD8-4B11
Dehydrator	Thermo Fisher	Excelsior ES
Digital pathology and	Indica labs	HALO
Foxp3	YILIFANG biological	14-477-82
IHC stainer	Leica	BOND III
Image analysis platform	Indica labs	HALO
Slide Scanner	Olympus life science	VS200