Modelo de metástasis de ganglios linfáticos de drenaje para evaluar la dinámica de las células T CD8+ específicas del antígeno durante la tumorigénesis
Summary
El diseño experimental presentado aquí proporciona un modelo reproductivo útil para los estudios de células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de ganglios linfáticos (LN), que excluye la perturbación de las células T CD8+ espectadoras.
Abstract
Las células T CD8+ específicas del antígeno tumoral de los ganglios linfáticos drenantes adquieren una importancia acumulativa en el montaje de la respuesta inmunitaria antitumoral durante la tumorigénesis. Sin embargo, en muchos casos, las células cancerosas forman loci metastásicos en los ganglios linfáticos antes de seguir haciendo metástasis en órganos distantes. No se sabe hasta qué punto las respuestas locales y sistemáticas de las células T CD8+ se vieron influidas por la metástasis de la LN. Con este fin, establecimos un modelo murino de metástasis LN combinado con una línea celular de melanoma B16F10-GP que expresa el neoantígeno sustituto derivado del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), la glicoproteína (GP) y los ratones transgénicos P14 que albergan receptores de células T (TCR) específicos del péptido derivado de GP GP33-41 presentado por la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I H-2Db. Este protocolo permite el estudio de las respuestas de los linfocitos T CD8+ específicos de antígeno durante la metástasis de LN. En este protocolo, a los ratones C57BL/6J se les implantaron por vía subcutánea células B16F10-GP, seguidas de una transferencia adoptiva con células P14 vírgenes. Cuando el tumor subcutáneo creció hasta aproximadamente 5 mm de diámetro, se extirpó el tumor primario y se inyectaron células B16F10-GP directamente en el ganglio linfático que drena el tumor (TdLN). A continuación, se monitorizó la dinámica de los linfocitos T CD8+ durante el proceso de metástasis de LN. En conjunto, este modelo ha proporcionado un enfoque para investigar con precisión las respuestas inmunitarias de las células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de LN.
Introduction
La inmunoterapia contra el cáncer, especialmente el bloqueo de puntos de control inmunitario (BCI), ha revolucionado la terapia contra el cáncer1. El BCI bloquea los inmunorreceptores coinhibidores (como PD-1, Tim-3, LAG-3 y TIGIT), que se expresan en gran medida en los linfocitos T CD8+ agotados en el microambiente tumoral (TME), lo que conduce a la revitalización de los linfocitos T CD8+ agotados2. Teniendo en cuenta la heterogeneidad de los linfocitos T CD8+ agotados, la evidencia acumulada reveló que los linfocitos T CD8+ específicos del tumor derivados de la periferia, incluido el ganglio linfático de drenaje (dLN), pero no en el TME, median la eficacia de la BCI 3,4,5,6,7,8. Recientemente, se confirmó que las células T CD8+ de memoria específicas para tumores TCF-1+TOX derivadas de TdLN (TdLN-T TSM) son las que responden genuinamente a la ICB, que incorporan varias propiedades funcionales de las células T de memoria convencionales y podrían expandirse y diferenciarse aún más en células agotadas de la progenie tras el tratamiento con ICB9. En conjunto, estos hallazgos corroboraron la importancia de la LN en el aumento de la inmunidad antitumoral.
Los ganglios linfáticos funcionan como un lugar crítico para facilitar el cebado y la activación de las células T CD8+ específicas del tumor al proporcionar una base estructural y señales biológicas10. Varios tipos de células cancerosas siembran con frecuencia el ganglio linfático centinela (GLC, el primer LN que drena un tumor primario) antes de la diseminación sistemática11. La presencia de metástasis en el GLC se relaciona con un pronóstico precario en el cáncer humano y los modelos preclínicos mostraron que las células tumorales en la NTdLN podrían diseminarse a órganos distantes a través de los vasos linfáticos y los vasos sanguíneos del ganglio 12,13,14,15. La biopsia de GLC ahora representa un procedimiento estándar para guiar las decisiones de tratamiento posteriores en muchos tipos de tumores sólidos, lo que podría evitar la resección innecesaria de LNno comprometida 16,17. Incluso para la LN afectada, sigue siendo controvertido si es necesaria la resección quirúrgica y cuándo, ya que varios estudios han demostrado que la extirpación de la LN regional no mostró una mejora de la supervivencia global en comparación con aquellos que recibieron radioterapia o terapia sistémica sin resección de la LN regional18,19. Una interpretación es que la LN metastásica (mLN) con enfermedad microscópica puede conservar cierta capacidad para educar a las células inmunitarias y proporcionar algunos beneficios terapéuticos. Por lo tanto, es de vital importancia dilucidar cómo la metástasis de LN afecta la respuesta inmune antitumoral, especialmente las propiedades y funciones de TdLN-TTSM.
Hasta ahora, tanto los datos preclínicos como los clínicos han revelado algunas alteraciones estructurales y celulares en mLN20. Sin embargo, no se han delineado los cambios dinámicos de las células T CD8+ específicas del tumor durante la metástasis de la LN. Por lo tanto, es necesario desarrollar un modelo convincente de metástasis de LN para futuras investigaciones. De hecho, varios estudios han reportado modelos de mLN en ratones a través de diferentes vías 14,21,22. Por ejemplo, la metástasis espontánea en las LN axilares se llevó a cabo mediante la implantación de células de cáncer de mama 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria22. En otro estudio, Reticker-Flynn et al. generaron líneas celulares de melanoma con alta incidencia de diseminación desde el tumor primario subcutáneo a las LN mediante la inoculación seriada de células tumorales cultivadas a partir de tejidos mLN disociados (nueve rondas)14. Otro modelo comúnmente utilizado se preparó mediante la inyección de células tumorales en la almohadilla del pie y los loci metastásicos se formarían en LN22 poplítea. En particular, es difícil evaluar los puntos temporales precisos de intervención porque la metástasis de LN en estos modelos no siempre es fiel.
En el presente estudio, se estableció un modelo murino de LN metastásico a través de la inyección intraganglionar de células B16F10-GP23,24, generadas por la inserción mediada por CRISPR/Cas9 de la secuencia génica de la glicoproteína (GP) del virus LCMV en el genoma de la línea celular B16F109. A continuación, estos ratones fueron transferidos con células P14 que albergan receptores de células T transgénicas (TCR) que reconocen específicamente el epítopo H-2Db GP33-41 25,26 y se pudo investigar la dinámica sistémica y local de las células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de LN. Nuestro diseño experimental proporciona un modelo útil para el estudio de las respuestas inmunes, especialmente de las células T CD8+ específicas de antígeno durante la metástasis de LN, lo que excluye la perturbación de las células T CD8+ espectadoras. Estos resultados afectarían a las opciones de tratamiento clínico de si se debe eliminar o retener la mLN y arrojarían nueva luz sobre la manipulación de la mLN para lograr los máximos beneficios terapéuticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la tumorigénesis, las células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) engullen a los antígenos tumorales y migran a TdLN, donde preparan las células T CD8+. Después del cebado y la activación, las células T CD8+ abandonan la TdLN y se infiltran en el tumor para destruir las células tumorales. A través de la resección de TdLN y la administración de FTY720 que bloquea la salida de las células inmunitarias de los órganos linfoides, vario…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias para Jóvenes Académicos Sobresalientes de China (n.º 82122028 a LX), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.º 82173094 a LX), la Fundación de Ciencias Naturales de Chong Qing (n.º 2023NSCQ-BHX0087 a SW).
Materials
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
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