Summary
Denne protokollen hadde som mål å beskrive detaljert veiledning om utarbeidelse av harde frøprøveseksjoner med lavt vanninnhold for MALDI-IMS-analyse, opprettholde analyttenes opprinnelige fordeling og overflod og gi signal- og romlig oppløsning av høy kvalitet.
Abstract
Matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering-avbildning massespektrometri (MALDI-IMS) brukes til å identifisere forbindelser i deres opprinnelige miljøer. For tiden brukes MALDI-IMS ofte i klinisk analyse. Likevel eksisterer et utmerket perspektiv for bedre å anvende denne teknikken for å forstå kjemiske forbindelsers fysiologiske informasjon i plantevev. Imidlertid kan forberedelse være utfordrende for spesifikke prøver fra botaniske materialer, da MALDI-IMS krever tynne skiver (12-20 μm) for passende datainnsamling og vellykket analyse. I denne forstand utviklet vi tidligere en prøveprepareringsprotokoll for å oppnå tynne seksjoner av Euterpe oleracea (açaí palm) harde frø, noe som muliggjorde molekylær kartlegging av MALDI-IMS.
Her viser vi at den utviklede protokollen er egnet for å forberede andre frø fra samme slekt. Kort fortalt var protokollen basert på å senke frøene i avionisert vann i 24 timer, legge inn prøver med gelatin og seksjonere dem i en akklimatisert kryostat. Deretter, for matriksavsetning, ble en xy-bevegelsesplattform koblet til en elektrosprayionisering (ESI) nålspray ved bruk av en 1: 1 (v / v) 2,5-dihydroksybenzoesyre (DHB) og metanoloppløsning med 0,1% trifluoreddiksyre ved 30 mg / ml. Data fra E. precatoria og E. edulis frø ble behandlet ved hjelp av programvare for å kartlegge metabolittmønstrene.
Hekso-oligomerer ble kartlagt i prøveskiver for å bevise at protokollen er tilstrekkelig for disse prøvene, da det er kjent at disse frøene inneholder store mengder mannan, en polymer av heksosemannose. Som et resultat ble topper av heksoseoligomerer, representert ved [M + K]+ addukter av (Δ = 162 Da), identifisert. Dermed muliggjorde prøveprepareringsprotokollen, tidligere utviklet skreddersydd for E. oleracea-frø , også MALDI-IMS-analyse av to andre harde palmefrø. Kort sagt, metoden kan utgjøre et verdifullt verktøy for forskning i morfo-anatomi og fysiologi av botaniske materialer, spesielt fra kuttresistente prøver.
Introduction
Matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering-avbildning massespektrometri (MALDI-IMS) er en kraftig metode som tillater todimensjonal biomolekyltildeling, gir målrettet undersøkelse av ioniserbare forbindelser og bestemmer deres romlige fordeling, spesielt i biologiske prøver 1,2. I to tiår har denne teknikken muliggjort samtidig påvisning og identifisering av lipider, peptider, karbohydrater, proteiner, andre metabolitter og syntetiske molekyler som terapeutiske legemidler 3,4. MALDI-IMS forenkler kjemisk analyse i en vevsprøveoverflate uten ekstraksjon, rensing, separasjon, merking eller fargestoffer av biologiske prøver. For vellykket analyse er imidlertid et sentralt trinn i denne teknikken prøveprepareringen, spesielt i plantevev, som er spesialisert og modifisert til utbredte komplekse organer på grunn av miljøakklimatisering5.
På grunn av de iboende fysisk-kjemiske egenskapene til plantevev, er det behov for en tilpasset protokoll for å passe kravene til MALDI-IMS-analyse og bevare vevets opprinnelige form under seksjoneringsforberedelse 6,7. Når det gjelder ukonvensjonelle prøver, for eksempel frø, er etablerte protokoller8 ikke anvendelige fordi disse vevene har stive cellevegger og lavt vanninnhold, noe som lett kan forårsake seksjonsfragmentering og føre til sammensatt delokalisering9.
Vår forskningsgruppe har publisert eksperimentelle data om molekylær kartlegging og en tilpasset protokoll for MALDI-IMS-analyse av açaí (Euterpe oleracea Mart.) frø 10,11,12, som er et biprodukt generert i høye mengder under produksjonen av den rentable açaí-massen 13. Tanken var å utvikle en protokoll for in situ kartlegging av forskjellige metabolitter i açaí-frø, og bidra til å foreslå mulige bruksområder for dette landbruksavfallet som for tiden ikke blir utforsket kommersielt. På grunn av motstanden til açaí-frøet var det imidlertid nødvendig å skreddersy en protokoll for å oppnå riktig prøveseksjonering fra MALDI-IMS-analyse.
I denne sammenheng har den økonomisk viktige açaí-massen motivert den økende kommersialiseringen av andre frukter fra Euterpe-slektens palmer med lignende sensoriske egenskaper. De to nye palmefruktene som har blitt produsert i industriell skala som et alternativ til açaí14,15 er E. precatoria (kjent som açaí-do-amazonas), som vokser i Amazonas tørrland, og E. edulis (kjent som juçara), som er typisk fra Atlanterhavskogen. Ikke desto mindre fører forbruket av açaí-do-amazonas og juçara til samme akkumulering av resistente og uspiselige frø som ikke er benyttet og ikke har blitt studert så langt med hensyn til deres detaljerte kjemiske sammensetning.
Dermed demonstrerer vi her at den tidligere utarbeidede protokollen kan brukes, med få tilpasninger, for å analysere E. precatoria og E. edulis frø for molekylær kartlegging av MALDI-IMS, som viser seg å være et kraftig verktøy som kan brukes til analyse av sammensetningen av disse ressursene og kan bidra til å bestemme deres potensielle bioteknologiske bruksområder. Videre kan den detaljerte beskrivelsen som er gitt her, hjelpe andre med lignende vanskeligheter med å forberede motstandsdyktige materialer for MALDI-IMS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Euterpe precatoria frø ble vennlig donert av Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brasil), og Euterpe edulis frø ble vennlig donert av Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brasil) etter den industrielle depulping prosessen. Frøene ble oppbevart i forseglede plastkasser ved romtemperatur.
1. Matriseassistert laser desorpsjon / ionisering-imaging massespektroskopi (MALDI-IMS)
- Protokoll for seksjonering av frø
- La tre frø fra hver art sitte i avionisert vann i 24 timer.
- Neste dag, slå på kryostaten, se materialfortegnelse, og la den nå -20 °C.
- Ta de våte frøene ut av vannet. Skjær frøene i to ved hjelp av et mikrotomblad (se materialfortegnelse).
- Forbered en frisk, varm (10%) gelatinløsning (se materialfortegnelse).
- Legg halvparten av frøet på en form og fyll det med nylaget gelatin. Frys ved -80 °C i 2 timer før du tar den til kryostat.
- Fest det innebygde frøet til kryostatstøtten ved hjelp av en optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT, se materialtabell) og la stå i 10 minutter inne i kryostaten for OCT-herding.
- Legg kobber dobbeltsidig tape (se Materialfortegnelse) til et indiumtinnoksidbelagt glassglass (ITO-lysbilde, se materialfortegnelse).
- Produser 20 μm tykke seksjoner fra hver art og plasser dem på kobber dobbeltsidig tape festet til ITO-glassglasset.
MERK: På dette tidspunktet kan skivene som samles på lysbildene lagres i en fryser på -80 °C. Alternativt kan du fortsette til matriseavsetning. Lysbildene må plasseres i en glideboks for holderen, skylles med gassformig N2 og forsegles med film for å forhindre prøveoksidering (se materialfortegnelse).
- Matriseavsetning
- Plasser lysbildet som inneholder skiver i en vakuumtørker til den når romtemperatur.
- Lag undervisningsmerker ved hjelp av en korreksjonspenn i hvert lysbildehjørne. Skann lysbildet med en bordskanner. Sett til oppløsningen på 4 800 ppt.
- Bruk en analytisk balanse til å veie 30 mg 2,5-dihydroksybenzoesyre (DHB; se materialtabell) og tilbered 1 ml 1:1 metanol:0,1% trifluoreddiksyre (TFA; Tabell over materialer) løsning for å oppløse DHB.
- Fyll en 1 ml glasssprøyte (se materialfortegnelse) med DHB-oppløsning og legg den i en sprøytepumpe (se materialfortegnelse) satt til en strømningshastighet på 0,8 ml/t.
- Bruk PEEK-slangen til å koble sprøyten til en atmosfærisk trykkkjemisk ioniseringsnål (APCI) (se materialfortegnelse).
- Koble N2 til APCI-nålen og sett den til en strømningshastighet på 12,5 psi .
- Fest APCI-kanylen til xy-bevegelsesplattformen (se materialfortegnelsen). Forsikre deg om at spissen av APCI-nålen er 4 cm over lysbildet.
- Bruk tegneprogramvaren (se Materialfortegnelse og tilleggsfigur 1) til å angi at xy-bevegelsesplattformen skal følge malen. Malen består av horisontale parallelle linjer fordelt med 1 mm.
- For å oppnå matriseavsetning, vent til xy-bevegelsesplattformen gjentar malen 20 ganger.
FORSIKTIG: Matriksavsetning må utføres i en kjemisk avtrekkshette.
- Oppkjøp av bildebehandling
- Plasser lysbildet i massespektrometeret (se Materialfortegnelse).
- Bruk rettelsespennemerker for å angi undervisningspoeng på programvaren det refereres til (se Materialfortegnelse).
- Still inn lasereffekten (60 %), laserfokus (medium), antall bilder (100) og polariteten i programvaren (se Materialfortegnelse). Angi 99 % datareduksjonsfaktor og lagre FID-filen for posterior datakalibrering. Lagre metoden.
- Avgrens området som skal analyseres ved hjelp av verktøyet add polygon measurement region fra programvaren for massespektrometer. Rediger måleområdeparametrene som angir metoden som ble lagret i forrige trinn, og rasterbredden til 100 μm (tilleggsfigur S4A).
- Start bildeoppkjøp.
- Analyse av data
- Bruk matriksklynge og kjente forurensninger til å lage en masseliste i den refererte programvaren (se Materialfortegnelse) i kategorien kalibrant (tilleggsfigur S4B).
- Åpne dataene som skal kalibreres i programvaren det refereres til (se Materialfortegnelse). I kategorien kalibrering åpner du masselisten som er opprettet, og åpner en dialogboks ved å høyreklikke og velge alternativet angi låsemasser (tilleggsfigur S4C).
- Velg Gaussisk vindusmodus med 0,5 Gaussisk utvidelse og 3,5 Linjeutvidelse. La kalibrering på nettet være umerket. Velg modus (enkel), terskel (1 000) og massetoleranse (5 spm). Kalibrer data med prosess og lagre 2D-dataverktøyet (tilleggsfigur S4C).
- Etter kalibrering eksporterer du dataene til SCiLS lab eller annen kompatibel programvare og angir ønsket m / z-verditerskel (valgt område: 150 til 2 500).
MERK: Avhengig av filstørrelsen eller datamaskinens egenskaper, kan dette ta litt tid. - Velg en normaliseringsmetode mellom totalt ionantall (TIC) eller rotmiddelkvadrat (RMS).
MERK: For denne analysen ble TIC valgt. - Hvis analyttene som skal kartlegges er kjent, plotter du hver m / z-verdi for hver analytt og lagrer de genererte bildene og spektralgjennomsnittplottet.
MERK: I dette arbeidet ble m/z-verdier fra heksoseoligomerer valgt ved å vurdere kaliumaddukten.
- Bruk matriksklynge og kjente forurensninger til å lage en masseliste i den refererte programvaren (se Materialfortegnelse) i kategorien kalibrant (tilleggsfigur S4B).
2. Energidispersiv spektroskopi (EDS)
- Protokoll for seksjonering av frø
- Skaff deg en tynn frøskive i en seksjonssagmaskin (se materialfortegnelse).
- Klipp frøene med følgende parametere: 500 RPM skjærehastighet, 100 N lastladning og 15 HC diamantfesteblad (se materialfortegnelse).
NOTAT: Håndter manuell fjerning av fibre fra frøene på grunn av nødvendig vedheft til holdet i presisjonsvisene festet til goniometeret. Rengjør bladet før bruk, kutt en del av frøet for å forhindre tilsetning av uønskede mineraler under analysen. - Fjern prøvene med trykkluft for å fjerne alle partikkelrester fra kuttet (se materialfortegnelse).
- Fest en frøseksjon i karbon dobbeltsidig ledende tape (se materialfortegnelse) i støtten.
- Analysebetingelser
- Fest støtten med en frøseksjon inne i vakuumkammeret til et skanningelektronmikroskop (SEM) kombinert med EDS (se materialtabell).
- Tilegne elektronmikrografer på et modellmikroskop med 20 kV akselerasjon og en punktstørrelse på 4,0, ved hjelp av sekundære elektronsignaler (se materialtabell), tilbakespredte elektroner (solid state detektor festet på polarstykket), og blandinger av disse to typer signaler (MIX), bygge kunstig fargede bilder.
- For oppkjøp av EDS-spektra, bruk et spektrometer (se materialtabell) kombinert med den nevnte SEM. Betingelseskonfigurasjonen for bildeoppkjøpet fra EDS er den samme som SEM.
- Angi hellingsgrader, høyde og asimut til henholdsvis 0,0, 35,0 og 0,0.
- Innsamling av data
- Sett tre forskjellige områder med 91x forstørrelse av frøseksjonen for å samle inn data.
- Identifiser toppene i spekteret ved avslutning av oppkjøpet eller under oppkjøpet. Bruk trinnknappen Bekreft elementer til å identifisere toppene manuelt.
- Sett innsamlingstiden til 60 s for hvert valgte område. Sett prosesstiden til fem; Parametrene er tilgjengelige for en prosesstid på en til seks.
MERK: Tegnene på elementene er konstante og legger opp, mens lydene er tilfeldige og skadelige. Jo lengre behandlingstid, jo lavere støy. - Standardinnstillingene for å vise signifikante kvantitative resultater er over to sigmaer (standardavvik). Sett to sigmaer til null for å redusere uønskede resultater.
- Normaliser hver intensitet av elementene; Dette er en standardisert parameter i programvaren (se Materialfortegnelse).
- Hvis du vil analysere dataene, eksporterer du dem i en DOC-fil.
- Analyse av data
- Sikre nøyaktig måling av toppintensiteter for kvantitativ elementær analyse.
- Overlappende topper krever dekonvolusjon for bedre toppseparasjon; Trekk fra en støyende bakgrunn når det er nødvendig.
- Når det ikke er overlapping, øker du forsterkningen for å forsterke signalene og forbedre spektrumkvaliteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den utarbeidede protokollen muliggjorde MALDI-IMS-analyse av E. precatoria og E. edulis frø. Som et resultat kunne vi bekrefte karbohydraters molekylvekt og polymerisasjonsgrad (DP) som en delvis strukturell oppklaring. Den molekylære informasjonen fra MALDI-IMS-analysen (figur 1 og figur 2) viste topper som representerte [M+K]+ addukter av heksoseoligomerer (Δ = 162 Da) uten å tilsette salt til matrisen. Heksosedimerer (m/z 381), trimere (m/z 543), tetramere (m/z 705), pentamere (m/z 867), heksamere (m/z 1029) og opptil 14-enhet oligomerer (m/z 2325) ble identifisert i begge frøvev. Boksplottene for begge prøvene (figur 3) indikerer toppintensiteten til hver heksoseoligomer som finnes i frøendospermen, og viser fordelingen og et litt høyere innhold av høye DP-oligomerer.
Tidligere ga vi EDS-data på E. oleracea-frø , noe som indikerte at kaliumaddukter oppdaget i MALDI-IMS-analysen skyldtes prøvens iboende karakteristikk av forhøyet kaliuminnhold10. Denne studien analyserte også frøene E. precatoria og E. edulis for å identifisere hovedelementene i utvalgets snitt (tilleggsfigur S2 og tilleggsfigur S3). Atomsammensetningen observert på vevsoverflaten ble homogent fordelt, og viste hovedsakelig ikke-mineralske elementer, som karbon og oksygen, og lavere mineralinnhold. I begge prøvene var kalium det viktigste mineralelementet funnet ved EDS-analyse (tilleggsfigur S2 og tilleggsfigur S3).
Figur 1: Heksose oligomer distribusjon i Euterpe precatoria frø av MALDI-IMS i positiv modus. (A) Massespektrum oppnådd. (B) Histologisk bilde og rammen som brukes til MALDI-IMS-analysen. (VG Nett) Bilderepresentasjoner av et spesifikt m/z-signal som beskriver dets intensitet i vevet for hver [M+K]+ addukt fra heksodimer (C), trimer (D), opptil 14 enheter (E-O) i frøets endosperm. Skalastang = 4 mm (B). Forkortelse: MALDI-IMS = matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering-avbildning massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Heksose oligomerfordeling i Euterpe edulis frø av MALDI-IMS i positiv modus. (A) Massespektrum oppnådd. (B) Histologisk bilde og rammen som brukes til MALDI-IMS-analysen. (VG Nett) Bilderepresentasjoner av et spesifikt m/z-signal som beskriver dets intensitet i vevet for hver [M+K]+ addukt fra heksodimer (C), trimer (D), opptil 14 enheter (E-O) i frøets endosperm. Skalastang = 5 mm (B). Forkortelse: MALDI-IMS = matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering-avbildning massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Visualiseringer av boksplott. (A) E. precatoria og (B) E. edulis, som indikerer maksimal intensitet og fordeling av hver heksose oligomer funnet i frøvevet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Mal for matrisebelegg. DHB-matrisen ble sprayet på plattformen ved hjelp av tegneprogramvare for lik fordeling på en 75 mm x 25 mm lysbilde med horisontale parallelle linjer fordelt på 1 mm. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Elementær komposisjonsanalyse av E. precatoria frø ved energidispersiv røntgenspektrometri. (A) E. precatoria frøprøve overflateseksjon. (B) Hovedelementer semi-kvantifisert. Hovedkomponentene tilsvarer ca. 47, 0% karbon (C), 52, 7% oksygen (O) og 0, 2% kalium (K). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S3: Elementær komposisjonsanalyse av E. edulis frø ved energidispersiv røntgenspektrometri. (A) E. edulis prøveoverflateseksjon. (B) Hovedelementer semi-kvantifisert. Hovedkomponentene tilsvarer ca. 47, 7% karbon (C), 53, 8% oksygen (O), 0, 3% kalium (K) og noen spor av klor (Cl). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S4: Avgrensning av området i en bilde- og dataanalyse. (A) Avgrensning av området som skal analyseres og redigering av parametrene og rasterbredden til 100 μm. (B) Identifisering av en matriseklynge og opprettelse av en masseliste. (C) Kalibrering av data og lagring av 2D-dataverktøyet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Planter består av spesialiserte vev for spesifikke biokjemiske funksjoner. Derfor må prøveprepareringsprotokollen for MALDI-IMS utformes i henhold til forskjellige plantevev med spesifikke fysisk-kjemiske egenskaper, da prøvene må opprettholde sin opprinnelige analyttfordeling og overflod for signal- og romlig oppløsning av høy kvalitet8.
Før MALDI-IMS-analyse er det primære hensynet å samle inn og lagre prøver på riktig måte. Men i planter varierer prøvepreparering ofte avhengig av det analyserte vevet. For eksempel kan cellevegglignifikasjon og vanninnhold i plantevev by på utfordringer under snitting for å opprettholde en nøyaktig fremstilling av morfologien i prøven7.
MALDI-IMS-analyse kan deles inn i en arbeidsflyt bestående av vevsforberedelse og seksjonering, matrisebelegg og dataanalyse. Imidlertid påvirkes kvaliteten og ektheten av bilderesultatene direkte av prøveprepareringsmetoden, noe som er et avgjørende skritt. Prøveprepareringsmetoden som ble brukt i denne studien var basert på en tidligere publisert protokoll for E. oleracea modent frø10. For å validere seksjoneringsprotokollen for andre prøver, evaluerte vi trinnene for prøveseksjonering ved hjelp av E. precatoria og E. edulis frø for å skaffe tynne (20 μm) seksjoner og muliggjøre MALDI-IMS-analyse med riktig oppløsning. Det meste av informasjonen er beskrevet i detalj i protokolldelen; Vi understreker imidlertid at manuell fjerning av eksternt fiberlag er et viktig skritt for å myke opp frøet, slik at bladseksjonering.
Standard histologiske arbeidsflyter frarådes vanligvis for MALDI-IMS, siden fikseringsprosedyrer kan føre til ioneundertrykkelseseffekter. Kryoseksjonering er den mest brukte metoden for prøvepreparering. Imidlertid kan prøvekrymping eller smuldring forekomme, noe som gir metabolittluksasjon og hindrer den biologiske tolkningen 5,8. En annen mulighet for bløtvev som blader og blomster er avtrykksmetoden. For denne studien, på grunn av det harde vevets natur og lave vanninnhold i prøvene, var teknikken som ble brukt før seksjonering å legge inn prøven med spesifikt materiale for å gi nøyaktige vevsseksjoner av høy kvalitet.
Det er bemerkelsesverdig at vevtykkelse kan føre til redusert signalintensitet. Totalt sett krever MALDI-IMS en <20 μm skivetykkelse for å gi tilstrekkelig oppløsning. Imidlertid bryter harde og store plantevev generelt under en tynn prøves seksjonering. For å løse dette problemet brukte protokollen et ledende tape laget av kobber16, noe som reduserte seksjonenes forvrengning og letter festing til lysbildet. Videre er det vanskelig å få en tynn del av hele frøet uten å suge det i avionisert vann over natten. Å legge inn prøven i denne tidsperioden kan imidlertid forårsake metabolittluksasjon. Derfor, i en tidligere publisert studie med E. oleracea frø11, sammenlignet vi små seksjoner (våte og tørre) med og uten bløtleggingstrinnet, hvorfra resultatene ikke indikerte noen dislokasjon for procyanidinene som ble funnet i frøtegumentet.
Matriksavsetning er et annet kritisk trinn for matrisehomogenitet på vevsseksjonsoverflaten, noe som sikrer analyttionisering. For MALDI-matriseavsetningen evaluerte vi i foreløpige tester forskjellige matriser, for eksempel 9-aminoakridin (9AA), α-cyano-4-hydroksykannaminsyre (HCCA), 1,5-diaminonaptalen (DAN) og 2,5-dihydroksybenzoesyre (DHB). DHB ble valgt som matrise siden den ga bedre oppløsning på karbohydratsignalene (data ikke vist) og også på grunn av dens "universelle analyse"natur 1; Imidlertid brukte den opprinnelige metoden en sublimeringstilnærming10,17, mens vi denne gangen benyttet automatisk robotsprøyting for å kontrollere matrisebeleggforholdene og gi en mer jevn applikasjon og mindre matrisekrystaller for et bilde med høyere oppløsning og for å unngå ioneundertrykkelseseffekter.
E. precatoria og E. edulis viser globooseformede frø med voluminøs homogen endosperm dekket av et tynt eksternt tegument, som bare adskiller seg fra E. oleracea frø på grunn av sin karakteristiske ruminerte endosperm 10,18,19. De ukonvensjonelle naturene som ble funnet for disse planteprøvene ga lignende prosesseringsvansker for de tilpassede seksjonerings- og matriseavsetningsprotokollene. Disse resultatene indikerer imidlertid at prøveprepareringen var tilstrekkelig og ga pålitelige og effektive bilder, som bestemte den romlige lokaliseringen av metabolitter i E. precatoria og E. edulis frø. MALDI-IMS-analysene muliggjorde potensiell utnyttelse av disse råmaterialene for første gang i litteraturen basert på molekylære kartleggingsdata.
EDS-dataene indikerte en tilstedeværelse av kalium lavere enn 1% i de analyserte frøvevene av E. edulis og E. precatoria. Konsentrasjonen var imidlertid høy nok til å gi [M+K]+ topper under MALDI-IMS-analysen. Tidligere publiserte studier hadde identifisert kalium som det viktigste mineralet som finnes i begge frøene20,21, noe som indikerer en naturlig tilstedeværelse av kalium i Euterpe-slektens frø og forklarer adduktene i MALDI-IMS-dataene for disse artene.
I denne studien evaluerte vi også konseptbeviset for at protokollen utviklet for E. oleracea-frøet ble implementert for E. precatoria og E. edulis frø. Reservepolysakkarid funnet i açaí (E. oleracea) frøets endosperm er hovedsakelig mannan22, hvis organisasjon er svært krystallinsk, forbedrer endospermhardheten for å oppnå tynne seksjoner av modne frø10,19. Tidligere studier kvantifiserte karbohydratene i endospermen til begge frøene ved gravimetriske metoder, og fant et innhold over 90% av frøets tørrvekt20,21. Videre antydet en histokjemistudie i E. edulis tilstedeværelsen av mannan i endospermen gjennom sin høyt krystallinske og sterke birefringence under polarisert lys18. Likevel er det ingen data om den kjemiske sammensetningen av reservekarbohydratene i begge frøenes endospermer. På grunn av deres fylogenetiske nærhet til E. oleracea frø, forventes heksoleoligomerer identifisert av MALDI-IMS også å være mannan-oligosakkarider. Likevel er det behov for fremtidige studier som evaluerer den kjemiske sammensetningen av disse reservepolysakkaridene for å bekrefte mannan- og mannan-oligosakkaridstrukturene i E. precatoria og E. edulis frø.
Denne protokollen kan brukes som et nyttig verktøy i studier av disse frøene, som går utover vårt beskrevne mål her. For eksempel kan denne teknikken være til nytte for analysen av biokjemiske prosesser under frøutvikling og spiring. Til slutt kan den detaljerte beskrivelsen gitt her være et nyttig utgangspunkt for å utarbeide tilpassede protokoller for analyse av MALDI-IMS av andre motstandsdyktige materialer fra planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Serrapilheira Institute (Serra-1708-15009), og Carlos Chagas Filho Foundation for Supporting Research in the State of Rio de Janeiro (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021). Serrapilheira Institute og National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) ga stipend til Dr. Felipe Lopes Brum og Dr. Gabriel R. Martins (Institutional Capacity Building Program / INT / MCTI). Koordineringen for forbedring av høyere utdanningspersonell (CAPES) er anerkjent for å gi et masterstipend for Mr. Davi M. M. C. da Silva. Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) er anerkjent for tjenestene som leveres med MALDI-IMS-analyser, og Alan Menezes do Nascimento og Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), finansiert av MCTI / SISNANO / INT-CENANO-CNPQ grant N º 442604/2019, takkes for den elementære komposisjonsanalysen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
References
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. , Elsevier Ltd. (2017).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).
- Qin, L., et al. Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants. Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).
- Bhandari, D. R., et al. High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas. Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).
- Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. Mass spectrometry imaging for plant biology: a review. Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).
- Dong, Y., et al. Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review. Frontiers in Plant Science. 7, 60 (2016).
- Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals. Food Chemistry. 398, 133911 (2023).
- Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474 (2023).
- Martins, G. R., et al. Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins. LWT. 132, 109830 (2020).
- Martins, G. R., et al. Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).
- Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment. Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).
- Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. Jussaí (Euterpe edulis): a review. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Yamaguchi, K. K. dL., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review. Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).
- Wu, R., et al. Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections. Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).
- Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids. Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).
- Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae). Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).
- Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis. Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).
- Alves, V. M., et al. Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Inada, K. O. P., et al. Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions. Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).
- Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis. Scientific Reports. 9 (1), 10939 (2019).
