Summary
Bu protokol, MALDI-IMS analizi için düşük su içeriğine sahip sert tohum numune kesitlerinin hazırlanması, analitlerin orijinal dağılımının ve bolluğunun korunması ve yüksek kaliteli sinyal ve uzamsal çözünürlük sağlanması hakkında ayrıntılı rehberliği tanımlamayı amaçlamıştır.
Abstract
Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi (MALDI-IMS), bileşikleri doğal ortamlarında tanımlamak için uygulanır. Şu anda, MALDI-IMS klinik analizlerde sıklıkla kullanılmaktadır. Yine de, bitki dokularındaki kimyasal bileşiklerin fizyolojik bilgilerini anlamak için bu tekniği daha iyi uygulamak için mükemmel bir bakış açısı mevcuttur. Bununla birlikte, MALDI-IMS, uygun veri toplama ve başarılı analiz için ince dilimler (12-20 μm) gerektirdiğinden, botanik materyallerden belirli numuneler için hazırlık zor olabilir. Bu anlamda, daha önce, Euterpe oleracea (açaí palmiyesi) sert tohumlarının ince kesitlerini elde etmek için bir numune hazırlama protokolü geliştirdik ve bunların MALDI-IMS ile moleküler haritalanmasını sağladık.
Burada, geliştirilen protokolün aynı cinsten diğer tohumların hazırlanması için uygun olduğunu gösteriyoruz. Kısaca protokol, tohumların 24 saat boyunca deiyonize suya batırılmasına, numunelerin jelatin ile gömülmesine ve iklimlendirilmiş bir kriyostatta bölümlere ayrılmasına dayanıyordu. Daha sonra, matris biriktirme için, bir xy hareket platformu, 1:1 (h/h) 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) ve 30 mg/mL'de %0.1 trifloroasetik asit içeren metanol çözeltisi kullanılarak bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) iğne spreyine bağlandı. E. precatoria ve E. edulis tohum verileri, metabolit modellerini haritalamak için yazılım kullanılarak işlendi.
Heksoz oligomerleri, bu numuneler için protokolün yeterliliğini kanıtlamak için numune dilimleri içinde haritalandı, çünkü bu tohumların büyük miktarlarda mannan içerdiği bilinmektedir. Sonuç olarak, [M + K]+ (Δ = 162 Da) eklentileri ile temsil edilen heksoz oligomerlerinin zirveleri tanımlandı. Böylece, daha önce E. oleracea tohumları için özel olarak geliştirilen numune hazırlama protokolü, diğer iki sert palmiye tohumunun MALDI-IMS analizini de mümkün kıldı. Kısacası, yöntem, özellikle kesilmeye dayanıklı numunelerden botanik materyallerin morfo-anatomisi ve fizyolojisi üzerine araştırmalar için değerli bir araç oluşturabilir.
Introduction
Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon-görüntüleme kütle spektrometrisi (MALDI-IMS), iki boyutlu biyomolekül atamasına izin veren, iyonlaşabilir bileşiklerin hedefsiz araştırılmasını sağlayan ve özellikle biyolojik örneklerde uzamsal dağılımlarını belirleyen güçlü bir yöntemdir 1,2. Yirmi yıldır bu teknik, lipitlerin, peptitlerin, karbonhidratların, proteinlerin, diğer metabolitlerin ve terapötik ilaçlar gibi sentetik moleküllerin eşzamanlı olarak saptanmasını ve tanımlanmasını sağlamıştır 3,4. MALDI-IMS, biyolojik numunelerin ekstraksiyonu, saflaştırılması, ayrılması, etiketlenmesi veya boyanması olmadan bir doku numunesi yüzeyinde kimyasal analizi kolaylaştırır. Bununla birlikte, başarılı bir analiz için, bu teknikte çok önemli bir adım, özellikle çevresel iklimlendirme nedeniyle yaygın karmaşık organlara özelleşmiş ve modifiye edilmiş bitki dokularında numune hazırlamadır5.
Doğal bitki dokusu fizikokimyasal özellikleri nedeniyle, MALDI-IMS analizinin gerekliliklerine uyacak ve kesit hazırlığı sırasında dokunun orijinal şeklini koruyacak uyarlanmış bir protokole ihtiyaç vardır 6,7. Tohumlar gibi geleneksel olmayan numuneler söz konusu olduğunda, bu dokular sert hücre duvarlarına ve düşük su içeriğine sahip olduğundan, oluşturulan protokoller8 uygulanamaz, bu da kolayca kesit parçalanmasına neden olabilir ve bileşik delokalizasyonayol açabilir 9.
Araştırma grubumuz, kiralanabilir açai posasının üretimi sırasında yüksek miktarlarda üretilen bir yan ürün olan açai (Euterpe oleracea Mart.)tohumu 10,11,12'nin moleküler haritalama ve MALDI-IMS analizi için uyarlanmış bir protokol hakkında deneysel veriler yayınlamıştır13. Buradaki fikir, açai tohumlarındaki farklı metabolitlerin yerinde haritalanması için bir protokol geliştirmek ve şu anda ticari olarak araştırılmayan bu tarımsal atıklar için olası kullanımları önermeye yardımcı olmaktı. Bununla birlikte, açai tohumunun direnci nedeniyle, MALDI-IMS analizinden uygun numune kesiti elde etmek için özel bir protokol yapılması gerekiyordu.
Bu bağlamda, ekonomik açıdan önemli olan açai posası, benzer duyusal özelliklere sahip Euterpe cinsi palmiye ağaçlarından elde edilen diğer meyvelerin artan ticarileşmesini motive etmiştir. Açaí 14,15'e alternatif olarak endüstriyel ölçekte üretilen iki palmiye ağacının meyvesi, Amazon kurak alanında yetişen E. precatoria (açaí-do-amazonas olarak bilinir) ve Atlantik Ormanı'ndan tipik olan E. edulis (juçara olarak bilinir). Bununla birlikte, açaí-do-amazonas ve juçara tüketimi, mevcut olmayan ve ayrıntılı kimyasal bileşimleri ile ilgili olarak şimdiye kadar çalışılmamış olan aynı dirençli ve yenmeyen tohum birikimine yol açmaktadır.
Bu nedenle, daha önce tasarlanan protokolün, MALDI-IMS tarafından moleküler haritalama için E. precatoria ve E. edulis tohumlarını analiz etmek için birkaç uyarlama ile kullanılabileceğini ve bu kaynakların bileşiminin analizi için kullanılabilecek güçlü bir araç olduğunu kanıtladığını ve potansiyel biyoteknolojik kullanımlarını belirlemeye yardımcı olabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, burada verilen ayrıntılı açıklama, MALDI-IMS analizi için dirençli malzemelerin hazırlanmasında benzer zorluklar yaşayan diğer kişilere yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Euterpe precatoria tohumları Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brezilya) tarafından nazikçe bağışlandı ve Euterpe edulis tohumları, endüstriyel hamur giderme işleminden sonra Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brezilya) tarafından nazikçe bağışlandı. Tohumlar oda sıcaklığında kapalı plastik kutularda tutuldu.
1. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon görüntüleme kütle spektroskopisi (MALDI-IMS)
- Tohum bölümleme protokolü
- Her türden üç tohumun 24 saat boyunca deiyonize suda oturmasına izin verin.
- Ertesi gün, kriyostatı açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve -20 °C'ye ulaşmasını bekleyin.
- Islak tohumları sudan çıkarın. Bir mikrotom bıçağı kullanarak tohumları ikiye bölün ( Malzeme Tablosuna bakın).
- Taze, ılık (% 10) bir jelatin çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Tohumun yarısını bir kalıba koyun ve taze yapılmış jelatin ile doldurun. Kriyostata almadan önce -80 °C'de 2 saat dondurun.
- Gömülü tohumu, optimum bir kesme sıcaklığı bileşiği (OCT, Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak kriyostat desteğine takın ve OCT sertleşmesi için kriyostatın içinde 10 dakika bekletin.
- İndiyum kalay oksit kaplı bir cam slayta (ITO slaytı; Malzeme Tablosuna bakın) bakır çift yüzlü yapışkan bant ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Her türden 20 μm kalınlığında kesitler üretin ve bunları ITO cam kızağa yapıştırılmış bakır çift yüzlü yapışkan bant üzerine yerleştirin.
NOT: Bu noktada slaytlar üzerinde toplanan dilimler -80 °C'lik bir dondurucuda saklanabilir; Alternatif olarak, matris biriktirmeye devam edin. Slaytlar bir tutucu slayt kutusuna yerleştirilmeli, gaz halindeN2 ile yıkanmalı ve numune oksidasyonunu önlemek için filmle kapatılmalıdır (bkz. Malzeme Tablosu).
- Matris biriktirme
- Dilimler içeren slaytı oda sıcaklığına gelene kadar vakumlu bir desikatöre yerleştirin.
- Her slayt köşesinde bir düzeltme kalemi kullanarak öğretim işaretleri yapın. Slaydı bir tablo tarayıcı kullanarak tarayın. 4.800 ppi çözünürlüğe ayarlayın.
- 30 mg 2,5-dihidroksibenzoik asidi (DHB; Malzeme Tablosuna bakınız) tartmak için bir analitik terazi kullanın ve 1 mL 1:1 metanol:% 0.1 trifloroasetik asit (TFA; Malzeme Tablosu) DHB'yi çözmek için çözelti.
- 1 mL'lik bir cam şırıngayı (Malzeme Tablosuna bakınız) DHB çözeltisi ile doldurun ve 0,8 mL / s akış hızına ayarlanmış bir şırınga pompasına (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
- PEEK borusunu kullanarak, şırıngayı atmosferik basınçlı kimyasal iyonizasyon (APCI) iğnesine bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
- N2'yi APCI iğnesine bağlayın ve 12.5 psi akış hızına ayarlayın.
- APCI iğnesini xy hareket platformuna takın (Malzeme Tablosuna bakın). APCI iğnesinin ucunun slayttan 4 cm yukarıda olduğundan emin olun.
- Çizim yazılımını kullanarak (bkz . Malzeme Tablosu ve Ek Şekil 1), xy hareket platformunu şablonu takip edecek şekilde ayarlayın. Şablon, 1 mm aralıklı yatay paralel çizgilerden oluşur.
- Matris biriktirme elde etmek için, xy hareket platformunun şablonu 20 kez tekrarlamasını bekleyin.
DİKKAT: Matris biriktirme kimyasal çeker ocakta yapılmalıdır.
- Görüntüleme edinimi
- Slaytı kütle spektrometresine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
- Başvurulan yazılımda öğretme noktalarını ayarlamak için düzeltme kalem işaretlerini kullanın (bkz.
- Yazılımda lazer gücünü (%60), lazer odağını (orta), çekim sayısını (100) ve polariteyi ayarlayın (bkz. %99 veri azaltma faktörünü ayarlayın ve FID dosyasını posterior veri kalibrasyonu için kaydedin. Yöntemi kaydedin.
- Kütle spektrometresi yazılımından poligon ölçüm bölgesi ekle aracını kullanarak analiz edilecek alanı sınırlayın. Önceki adımda kaydedilen yöntemi ve raster genişliğini 100 μm olarak gösteren ölçüm bölgesi parametrelerini düzenleyin (Ek Şekil S4A).
- Görüntüleme alımını başlatın.
- Veri analizi
- Kalibant sekmesinde (Ek Şekil S4B) referans verilen yazılımda (Malzeme Tablosuna bakın) bir kütle listesi oluşturmak için matris kümesini ve bilinen kirleticileri kullanın.
- Referans verilen yazılımda kalibre edilecek verileri açın (bkz. Kalibrasyon sekmesinde, oluşturulan kütle listesini açın ve sağ tıklayarak bir iletişim kutusu açın ve kilit kütlelerini ayarla seçeneğini seçin (Ek Şekil S4C).
- 0,5 Gauss genişletme ve 3,5 Satır genişletme ile Gauss pencere modunu seçin. Çevrimiçi kalibrasyonu işaretlemeden bırakın. Mod (tek), eşik (1.000) ve kütle toleransı (5 ppm) seçin. Verileri işlemle kalibre edin ve 2D veri aracını kaydedin (Ek Şekil S4C).
- Kalibrasyondan sonra, verileri SCiLS laboratuvarına veya diğer uyumlu yazılımlara aktarın ve istenen m/z değeri eşiğini ayarlayın (seçilen aralık: 150 ila 2.500).
NOT: Dosya boyutuna veya bilgisayarın özelliklerine bağlı olarak bu işlem biraz zaman alabilir. - Toplam iyon sayısı (TIC) veya ortalama karekök (RMS) arasında bir normalleştirme yöntemi seçin.
NOT: Bu analiz için TIC seçilmiştir. - Eşlenecek analitler biliniyorsa, her analit için her m/z değerini çizin ve oluşturulan görüntüleri ve spektral ortalama grafiğini kaydedin.
NOT: Bu çalışmada heksoz oligomerlerinden m/z değerleri potasyum eklentisi dikkate alınarak seçilmiştir.
- Kalibant sekmesinde (Ek Şekil S4B) referans verilen yazılımda (Malzeme Tablosuna bakın) bir kütle listesi oluşturmak için matris kümesini ve bilinen kirleticileri kullanın.
2. Enerji dağılımlı spektroskopi (EDS)
- Tohum bölümleme protokolü
- Bir kesit testere makinesinde ince bir tohum dilimi elde edin (Malzeme Tablosuna bakın).
- Tohumları aşağıdaki parametrelerle kesin: 500 RPM kesme hızı, 100 N yük yükü ve 15 HC Elmas Gofret Bıçağı (Malzeme Tablosuna bakın).
NOT: Gonyometreye bağlı hassas mengenelerdeki tutuşa gerekli yapışma nedeniyle liflerin tohumlardan manuel olarak çıkarılmasını sağlayın. Analiz sırasında istenmeyen minerallerin eklenmesini önlemek için tohumun bir bölümünü keserek kullanmadan önce bıçağı temizleyin. - Kesimdeki tüm partikül kalıntılarını gidermek için numuneleri basınçlı hava ile temizleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Destekte bir tohum bölümünü karbon çift taraflı iletken bantla ( Malzeme Tablosuna bakın) sabitleyin.
- Analiz koşulları
- Desteği, EDS ile birleştirilmiş bir taramalı elektron mikroskobunun (SEM) vakum odasının içindeki bir tohum bölümü ile takın (bkz. Malzeme Tablosu).
- İkincil elektron sinyallerini (Malzeme Tablosuna bakınız), geri saçılan elektronları (polar parçaya sabitlenmiş katı hal dedektörü) ve bu iki tür sinyalin karışımlarını (MIX) kullanarak 20 kV ivmeli ve 4.0 spot boyutlu bir model mikroskopta elektron mikrografları elde edin, yapay olarak renklendirilmiş görüntüler oluşturun.
- EDS spektrumlarının elde edilmesi için, yukarıda belirtilen SEM ile birleştirilmiş bir spektrometre (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. EDS'den görüntü alımının koşul yapılandırması SEM ile aynıdır.
- Eğim derecelerini, yüksekliği ve azimutu sırasıyla 0,0, 35,0 ve 0,0 olarak ayarlayın.
- Veri toplama
- Veri elde etmek için tohum bölümünün 91x büyütmesi ile üç farklı alan ayarlayın.
- Satın almanın sona ermesi üzerine veya satın alma sırasında spektrumdaki tepe noktalarını belirleyin. Tepe noktalarını manuel olarak tanımlamak için Öğeleri Onayla adım düğmesini kullanın.
- Seçilen her alan için çekim süresini 60 sn olarak ayarlayın. İşlem süresini beşe ayarlayın; Parametreler bir ila altı işlem süresi için kullanılabilir.
NOT: Öğelerin işaretleri sabittir ve toplanırken, sesler rastgele ve zararlıdır. İşlem süresi ne kadar uzun olursa, gürültü o kadar düşük olur. - Önemli nicel sonuçları görüntülemek için varsayılan ayarlar iki sigmanın (standart sapma) üzerindedir. İstenmeyen sonuçları azaltmak için iki sigmayı sıfıra ayarlayın.
- Elemanların her yoğunluğunu normalleştirin; bu, yazılımda standartlaştırılmış bir parametredir (bkz.
- Verileri analiz etmek için bir DOC dosyasına aktarın.
- Veri analizi
- Kantitatif element analizi için tepe yoğunluklarının doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayın.
- Üst üste binen tepeler, daha iyi tepe ayrımı için evrişim gerektirir; Gerektiğinde gürültülü bir arka planı çıkarın.
- Örtüşme olmadığında, sinyalleri yükseltmek ve spektrum kalitesini iyileştirmek için kazancı artırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tasarlanan protokol, E. precatoria ve E. edulis tohumlarının MALDI-IMS analizini mümkün kıldı. Sonuç olarak, karbonhidratların moleküler ağırlığını ve polimerizasyon derecesini (DP) kısmi bir yapısal açıklama olarak doğrulayabiliriz. MALDI-IMS analizi (Şekil 1 ve Şekil 2) tarafından sağlanan moleküler bilgiler, matrise tuz eklemeden heksoz oligomerlerinin (Δ = 162 Da) [M+K]+ eklentilerini temsil eden pikler sergiledi. Her iki tohum dokusunda heksoz dimerleri (m/z 381), trimerler (m/z 543), tetramerler (m/z 705), pentamerler (m/z 867), heksamerler (m/z 1029) ve 14 birime kadar oligomerler (m/z 2325) tanımlanmıştır. Her iki numune için kutu grafikleri (Şekil 3), tohum endosperminde bulunan her bir heksoz oligomerinin tepe yoğunluğunu gösterir, dağılımlarını ve biraz daha yüksek DP oligomer içeriğini gösterir.
Daha önce, MALDI-IMS analizinde tespit edilen potasyum eklentilerinin, numunenin yüksek potasyum içeriğinin10 içsel özelliğinden kaynaklandığını gösteren E. oleracea tohumları hakkında EDS verileri sağlamıştık. Bu çalışmada ayrıca E. precatoria ve E. edulis tohumları, numunenin bölümlerindeki ana unsurları belirlemek için analiz edilmiştir (Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3). Doku yüzeyinde gözlenen atomik bileşim homojen bir şekilde dağılmış, esas olarak karbon ve oksijen gibi mineral olmayan elementler ve daha düşük mineral içeriği göstermiştir. Her iki örnekte de potasyum, EDS analizi ile bulunan ana mineral elementti (Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3).
Şekil 1: Pozitif modda MALDI-IMS ile Euterpe precatoria tohumlarında heksoz oligomer dağılımı. (A) Elde edilen kütle spektrumu. (B) Histolojik görüntü ve MALDI-IMS analizi için kullanılan çerçeve. (C-O) Tohumların endosperminde 14 birime (E-O) kadar heksoz dimer (C), trimer (D)'den her [M+K]+ eklentisi için dokudaki yoğunluğunu tanımlayan belirli bir m/z sinyalinin görüntü temsilleri. Ölçek çubuğu = 4 mm (B). Kısaltma: MALDI-IMS = matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon-görüntüleme kütle spektrometrisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Euterpe edulis tohumlarında pozitif modda MALDI-IMS ile heksoz oligomer dağılımı. (A) Elde edilen kütle spektrumu. (B) Histolojik görüntü ve MALDI-IMS analizi için kullanılan çerçeve. (C-O) Tohumların endosperminde 14 birime (E-O) kadar heksoz dimer (C), trimer (D)'den her [M+K]+ eklentisi için dokudaki yoğunluğunu tanımlayan belirli bir m/z sinyalinin görüntü temsilleri. Ölçek çubuğu = 5 mm (B). Kısaltma: MALDI-IMS = matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon-görüntüleme kütle spektrometrisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kutu grafiği görselleştirmeleri. (A) E. precatoria ve (B) E. edulis, tohum dokusunda bulunan her bir heksoz oligomerinin tepe yoğunluğunu ve dağılımlarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Matris kaplama şablonu. DHB matrisi, 1 mm aralıklı yatay paralel çizgilerden oluşan 75 mm x 25 mm'lik bir slayt üzerinde eşit dağılım için çizim yazılımı kullanılarak platforma püskürtüldü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S2: Enerji dağıtıcı X-ışını spektrometrisi ile E. precatoria tohumlarının temel bileşim analizi. (A) E. precatoria tohum numunesi yüzey bölümü. (B) Ana unsurlar yarı nicelleştirilmiştir. Ana bileşenler yaklaşık %47.0 karbon (C), %52.7 oksijen (O) ve %0.2 potasyum (K) 'ye karşılık gelir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S3: Enerji dağıtıcı X-ışını spektrometrisi ile E. edulis tohumlarının temel bileşim analizi. (A) E. edulis numune yüzey kesiti. (B) Ana unsurlar yarı nicelleştirilmiştir. Ana bileşenler yaklaşık% 47.7 karbon (C),% 53.8 oksijen (O),% 0.3 potasyum (K) ve bazı eser miktarda klor (Cl) 'ye karşılık gelir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S4: Bir görüntü ve veri analizinde alanın sınırlandırılması. (A) Analiz edilecek alanın sınırlandırılması ve parametrelerin ve raster genişliğinin 100 μm'ye kadar düzenlenmesi. (B) Bir matris kümesinin tanımlanması ve bir kütle listesinin oluşturulması. (C) Verilerin kalibrasyonu ve 2D veri aracının kaydedilmesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bitkiler, belirli biyokimyasal işlevler için özel dokulardan oluşur. Bu nedenle, numunelerin yüksek kaliteli sinyal ve uzamsal çözünürlük için orijinal analit dağılımını ve bolluğunu koruması gerektiğinden, MALDI-IMS için numune hazırlama protokolü, spesifik fizikokimyasal özelliklere sahip çeşitli bitki dokularına göre tasarlanmalıdır8.
MALDI-IMS analizinden önce, numunelerin uygun şekilde toplanması ve saklanması öncelikli olarak düşünülür. Bununla birlikte, bitkilerde, numune hazırlama genellikle analiz edilen dokuya bağlı olarak değişir. Örneğin, bitki dokularındaki hücre duvarı odunlaşması ve su içeriği, numune7'deki morfolojinin doğru bir temsilini sağlamak için kesitleme sırasında zorluklar oluşturabilir.
MALDI-IMS analizi, doku hazırlama ve kesit alma, matris kaplama ve veri analizinden oluşan bir iş akışına bölünebilir. Bununla birlikte, görüntüleme sonuçlarının kalitesi ve gerçekliği, çok önemli bir adım olan numune hazırlama yönteminden doğrudan etkilenir. Bu çalışmada kullanılan numune hazırlama yöntemi, E. oleracea olgun tohum10 için daha önce yayınlanmış bir protokole dayanmaktadır. Diğer numuneler için kesit alma protokolünü doğrulamak için, ince (20 μm) kesitler elde etmek ve uygun çözünürlükte MALDI-IMS analizini sağlamak için E. precatoria ve E. edulis tohumlarını kullanarak numune kesit alma adımlarını değerlendirdik. Çoğu bilgi protokol bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır; Bununla birlikte, manuel dış elyaf tabakasının çıkarılmasının, tohumu yumuşatmak için önemli bir adım olduğunu ve bıçak kesitlerine izin verdiğini vurguluyoruz.
Standart histolojik iş akışları genellikle MALDI-IMS için önerilmez, çünkü fiksasyon prosedürleri iyon bastırma etkilerine yol açabilir. Kriyoseksiyon, numune hazırlama için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bununla birlikte, metabolit çıkığına neden olan ve biyolojik yorumu engelleyen numune büzülmesi veya ufalanması meydana gelebilir 5,8. Yaprak ve çiçek gibi yumuşak dokular için bir başka olasılık da baskı yöntemidir. Bununla birlikte, bu çalışma için, numunelerdeki sert doku yapısı ve düşük su içeriği nedeniyle, kesitlemeden önce kullanılan teknik, doğru, yüksek kaliteli doku kesitleri sağlamak için numuneyi belirli bir malzeme ile gömmekti.
Doku kalınlığının sinyal yoğunluğunun azalmasına yol açabileceği dikkat çekicidir. Genel olarak, MALDI-IMS, yeterli çözünürlüğü sağlamak için <20 μm'lik bir dilim kalınlığı gerektirir. Bununla birlikte, sert ve büyük bitki dokuları genellikle ince bir numunenin kesitlenmesi sırasında kırılır. Bu sorunu çözmek için protokol, bakır16'dan yapılmış iletken bir yapışkan bant kullandı, bu da bölümlerin bozulmasını azalttı ve slayta bağlanmayı kolaylaştırdı. Ayrıca, tüm tohumun ince bir bölümünü gece boyunca deiyonize suya batırmadan elde etmek zordur. Bununla birlikte, numunenin bu süre boyunca gömülmesi metabolit çıkığına neden olabilir; bu nedenle, E. oleracea tohumu11 ile daha önce yayınlanmış bir çalışmada, ıslatma adımı olan ve olmayan küçük bölümleri (ıslak ve kuru) karşılaştırdık, bu da sonuçların tohum tegumentinde bulunan prosiyanidinler için herhangi bir yer değiştirmediğini gösterdi.
Matris birikimi, doku kesiti yüzeyinde matris homojenliği için bir başka kritik adımdır ve analit iyonizasyonunu sağlar. MALDI matris birikimi için, ön testlerde 9-aminoakridin (9AA), α-siyano-4-hidroksisinnamik asit (HCCA), 1,5-diaminonaftalen (DAN) ve 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) gibi farklı matrisleri değerlendirdik. DHB, karbonhidrat sinyalleri üzerinde daha iyi çözünürlük sağladığı için (veriler gösterilmemiştir) ve ayrıca "evrensel analiz" doğası nedeniyle matris olarak seçilmiştir1; Bununla birlikte, orijinal yöntem bir süblimasyon yaklaşımı10,17 kullanırken, bu sefer matris kaplama koşullarını kontrol etmek ve daha yüksek çözünürlüklü bir görüntü için daha homojen bir uygulama ve daha küçük matris kristalleri sağlamak ve iyon bastırma etkilerinden kaçınmak için otomatik robotik püskürtme kullandık.
E. precatoria ve E. edulis, karakteristik geviş getiren endospermi nedeniyle sadece E. oleracea tohumlarından farklı olan ince bir dış tegument ile kaplı hacimli homojen endosperme sahip küresel şekilli tohumlar sergiler 10,18,19. Bu bitki örnekleri için bulunan alışılmadık doğalar, uyarlanmış kesitleme ve matris biriktirme protokolleri için benzer işleme zorlukları sağlamıştır. Bununla birlikte, bu sonuçlar, numune hazırlamanın yeterli olduğunu ve E. precatoria ve E. edulis tohumlarındaki metabolitlerin uzamsal lokalizasyonunu belirleyen güvenilir ve etkili görüntüler sağladığını göstermektedir. MALDI-IMS analizleri, moleküler haritalama verilerine dayanarak literatürde ilk kez bu hammaddelerin potansiyel olarak kullanılmasını sağladı.
EDS verileri, E. edulis ve E. precatoria'nın analiz edilen tohum dokularında% 1'den daha düşük bir potasyum varlığını göstermiştir. Bununla birlikte, konsantrasyon, MALDI-IMS analizi sırasında [M + K] + pikleri sağlayacak kadar yüksekti. Daha önce yayınlanmış çalışmalar, potasyumu her iki tohumda da bulunan ana mineral olarak tanımlamıştı20,21, bu da Euterpe cinsi tohumlarda doğal bir potasyum varlığını gösteriyor ve bu türlerin MALDI-IMS verilerindeki eklentileri açıklıyor.
Bu çalışmada, E. oleracea tohumu için geliştirilen protokolün E. precatoria ve E. edulis tohumları için uygulandığının ispatı da değerlendirilmiştir. Açai (E. oleracea) tohumunun endosperminde bulunan rezerv polisakkarit, organizasyonu oldukça kristalli olan ve olgun tohumların10,19 ince kesitlerini elde etmek için endosperm sertliğini artıran büyük ölçüde mannan22'dir. Önceki çalışmalar, her iki tohumun endospermindeki karbonhidratları gravimetrik yöntemlerle ölçmüş ve tohumların kuru ağırlığının %90'ının üzerinde bir içerik bulmuştur20,21. Ayrıca, E. edulis'te yapılan bir histokimya çalışması, polarize ışık altında yüksek kristalli ve güçlü çift kırılması yoluyla endospermde mannan varlığını öne sürdü18. Bununla birlikte, her iki tohumun endospermindeki rezerv karbonhidratların kimyasal bileşimi hakkında veri yoktur. E. oleracea tohumuna filogenetik yakınlıkları nedeniyle, MALDI-IMS tarafından tanımlanan heksoz oligomerlerinin de mannan-oligosakkaritler olması beklenmektedir. Yine de, E. precatoria ve E. edulis tohumlarındaki mannan ve mannan-oligosakkarit yapılarını doğrulamak için bu rezerv polisakkaritlerin kimyasal bileşimini değerlendiren gelecekteki çalışmalara ihtiyaç vardır.
Bu protokol, burada açıklanan hedefimizin ötesine geçen tohumların çalışmalarında yararlı bir araç olarak uygulanabilir. Örneğin, bu teknik, tohum gelişimi ve çimlenme sırasında biyokimyasal süreçlerin analizine fayda sağlayabilir. Son olarak, burada verilen ayrıntılı açıklama, bitkilerden elde edilen diğer dirençli malzemelerin MALDI-IMS tarafından analizi için uyarlanmış protokoller tasarlamak için yararlı bir başlangıç noktası olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma Serrapilheira Enstitüsü (Serra-1708-15009) ve Carlos Chagas Filho Rio de Janeiro Eyaletindeki Araştırmaları Destekleme Vakfı (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021) tarafından finanse edilmiştir. Serrapilheira Enstitüsü ve Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq), Dr. Felipe Lopes Brum ve Dr. Gabriel R. Martins'e (Kurumsal Kapasite Geliştirme Programı/INT/MCTI) burs verdi. Yüksek Öğretim Personelinin Geliştirilmesi Koordinasyonu (CAPES), Bay Davi M. M. C. da Silva'ya Yüksek Lisans bursu verdiği için kabul edilmektedir. Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ), MALDI-IMS analizleri ile sağlanan hizmetler için tanınmaktadır ve Bay Alan Menezes do Nascimento ve Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ hibe Nº 442604/2019 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81320 | |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 149357 | |
| APCI needle | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 602193 | |
| AxiDraw V3 xy motion platform | Evil Mad Scientist, CA, USA | 2510 | |
| Carbon double-sided conductive tape | |||
| Compass Data Analysis software | creation of mass list | ||
| Compressed air | |||
| copper double-faced adhesive tape | 3M, USA | 1182-3/4"X18YD | |
| Cryostat CM 1860 UV | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | ||
| Diamond Wafering Blade 15 HC | |||
| Everhart-Thornley detector | |||
| FlexImaging | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | image acquisition | |
| FTMS Processing | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | data calibration | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma Aldrich Co, MO, USA | G9391 | |
| High Profile Microtome Blades Leica 818 | Leica Biosystems, Nussloch, Germany | 0358 38926 | |
| indium tin oxide coated glass slide | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8237001 | |
| Inkscape | Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA | ||
| IsoMet 1000 precision cutter | Buehler, Illinois, USA | ||
| Methanol | J.T.Baker | 9093-03 | |
| Mili-Q water | 18.2 MΩ.cm | ||
| Oil vacuum pump | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound | Fisher HealthCare, Texas, USA | 4585 | |
| Parafilm "M" Sealing Film | Amcor | HS234526B | |
| Quanta 450 FEG | FEI Co, Hillsboro, OR, USA | ||
| SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Software INCA Suite 4.14 V | Oxford Instruments, Ableton, UK | ||
| Solarix 7T | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | ||
| Syringe pump | kdScientific, MA, USA | 78-9100K | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Co, MO, USA | 302031 | |
| X-Max spectrometer | Oxford Instruments, Ableton, UK |
References
- Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
- Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. , Elsevier Ltd. (2017).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).
- Qin, L., et al. Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants. Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).
- Bhandari, D. R., et al. High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas. Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).
- Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. Mass spectrometry imaging for plant biology: a review. Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).
- Dong, Y., et al. Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review. Frontiers in Plant Science. 7, 60 (2016).
- Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals. Food Chemistry. 398, 133911 (2023).
- Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474 (2023).
- Martins, G. R., et al. Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins. LWT. 132, 109830 (2020).
- Martins, G. R., et al. Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).
- Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment. Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).
- Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. Jussaí (Euterpe edulis): a review. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Yamaguchi, K. K. dL., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review. Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).
- Wu, R., et al. Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections. Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).
- Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids. Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).
- Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae). Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).
- Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis. Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).
- Alves, V. M., et al. Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments. Food Science and Technology. 42, (2022).
- Inada, K. O. P., et al. Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions. Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).
- Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis. Scientific Reports. 9 (1), 10939 (2019).
