Pseudotypede vira (PV’er) er replikationsdefekte virioner, der bruges til at studere værtsvirusinteraktioner under sikrere forhold end håndtering af autentiske vira. Her præsenteres en detaljeret protokol, der viser, hvordan SARS-CoV-2 PV’er kan bruges til at teste den neutraliserende evne hos patienters serum efter COVID-19-vaccination.
Pseudotypede vira (PV’er) er molekylære værktøjer, der kan bruges til at studere værtsvirusinteraktioner og til at teste serumprøvers neutraliserende evne ud over deres bedre kendte anvendelse i genterapi til levering af et gen af interesse. PV’er er replikationsdefekte, fordi det virale genom er opdelt i forskellige plasmider, der ikke er inkorporeret i PV’erne. Dette sikre og alsidige system tillader brug af solceller i laboratorier med biosikkerhedsniveau 2. Her præsenterer vi en generel metode til fremstilling af lentivirale PV’er baseret på tre plasmider som nævnt her: (1) rygradsplasmidet, der bærer reportergenet, der er nødvendigt for at overvåge infektionen; 2) emballageplasmidet, der bærer generne for alle de strukturelle proteiner, der er nødvendige for at generere solcellerne (3) kuvertoverfladen glycoproteinekspressionsplasmid, der bestemmer virustropisme og medierer viral indgang i værtscellen. I dette arbejde er SARS-CoV-2 Spike det kuvertglycoprotein, der anvendes til produktion af ikke-replikative SARS-CoV-2 pseudotypede lentivirus.
Kort fortalt blev emballeringsceller (HEK293T) co-transfekteret med de tre forskellige plasmider ved hjælp af standardmetoder. Efter 48 timer blev supernatanten indeholdende PV’erne høstet, filtreret og opbevaret ved -80 °C. Infektiviteten af SARS-CoV-2 PV’er blev testet ved at studere ekspressionen af reportergenet (luciferase) i en målcellelinje 48 timer efter infektion. Jo højere værdien for relative luminescensenheder (RLU’er), jo højere er infektions-/transduktionshastigheden. Desuden blev de infektiøse PV’er tilsat til de serielt fortyndede serumprøver for at studere neutraliseringsprocessen for pseudovirus’ indtræden i målceller, målt som reduktionen i RLU-intensitet: lavere værdier svarende til høj neutraliserende aktivitet.
Pseudotypede vira (PV’er) er molekylære værktøjer, der anvendes i mikrobiologi til at studere værtsvirus og patogen-patogeninteraktioner 1,2,3,4. PV’er består af en indre del, den virale kerne, der beskytter det virale genom, og en ydre del, kuvertglycoproteinerne på overfladen af virussen, der definerer tropismen5. Et pseudovirus er replikationsinkompetent i målcellen, fordi det ikke indeholder al den genetiske information til at generere nye virale partikler. Denne kombination af ejendommelige funktioner gør PV’er til et sikkert alternativ til en vildtypevirus. Vildtypevirus er derimod højpatogene og kan ikke anvendes i BSL 2-laboratorier til analyse6.
Infektiviteten af PV’er kan overvåges af et reportergen, der normalt koder for et fluorescerende protein (GFP, RFP, YFP) eller et enzym, der producerer kemiluminescerende produkter (luciferase). Dette er indeholdt i et af plasmiderne, der anvendes til PV-produktion og inkorporeret i pseudovirusets genom7.
Der findes i øjeblikket flere typer PV-kerner, herunder lentivirale afledte partikler baseret på HIV-1-genomet. Den store fordel ved HIV-1-baserede solceller i forhold til andre platforme er deres iboende integrationsproces i målcellegenomet8. Selvom HIV-1 er en meget smitsom virus og er årsagsmidlet til aids, er disse lentivirale vektorer sikre at bruge på grund af de omfattende optimeringstrin gennem årene. Optimale sikkerhedsforhold blev opnået med introduktionen af 2. generations lentivirale vektorer, hvor virale gener blev udtømt uden at påvirke transduktionsevnen9. 3. og 4. generation bidrog til den øgede sikkerhed ved lentiviral vektorhåndtering med yderligere opdeling af det virale genom i separate plasmider10,11. De nyeste generationer af PV’er anvendes generelt til at producere lentivirale vektorer til genterapi.
PV’er kan bruges til at studere interaktioner mellem vira og værtsceller under både produktions- og infektionsfaserne. PV’er anvendes især i pseudovirusneutraliseringsassays (PVNA). PVNA’er valideres bredt for at vurdere neutraliseringspotentialet for serum eller plasma ved at målrette det virale glycoprotein på PV’s kuvert12,13. Neutraliseringsaktivitet, udtrykt som den hæmmende koncentration 50 (IC50), defineres som fortynding af serum/plasma, der blokerer 50% af viral partikelindgang14. I denne protokol beskrev vi opsætningen af et PVNA til test af antistofaktiviteten mod alvorligt akut respiratorisk syndrom – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i sera indsamlet før og efter modtagelse af en boostervaccinedosis.
Selvom brug af en vildtypevirus simulerer den faktiske infektion, er lentivirale PV’er en sikrere mulighed for at studere mekanismerne forbundet med viral indgang og infektion uden de strenge sikkerhedskrav, der er nødvendige for at arbejde med patogene vira 4,20,21. PV’er består af en replikationsdefekt viral kerne omgivet af overfladehylsterglycoprotein af en patogen virus, hvilket er formålet med undersøgelsen.
<p cla…The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender bidraget fra sundhedspersonalets frivillige. Dette projekt blev støttet af Department of Excellence 2023/2027, MUR, Italien. AR og DZ blev støttet af PRIN2022 (EU-finansiering; NextGenerationEU)
0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |