Pseudotypede virus (PVer) er replikasjonsdefekte virioner som brukes til å studere vertsvirusinteraksjoner under tryggere forhold enn å håndtere autentiske virus. Presentert her er en detaljert protokoll som viser hvordan SARS-CoV-2 PV-er kan brukes til å teste nøytraliseringsevnen til pasienters serum etter COVID-19-vaksinasjon.
Pseudotypede virus (PV) er molekylære verktøy som kan brukes til å studere vertsvirusinteraksjoner og for å teste serumprøvers nøytraliserende evne, i tillegg til deres bedre kjente bruk i genterapi for levering av et gen av interesse. PV er replikasjonsdefekt fordi virusgenomet er delt inn i forskjellige plasmider som ikke er innlemmet i PVene. Dette sikre og allsidige systemet tillater bruk av PV i biosikkerhetsnivå 2-laboratorier. Her presenterer vi en generell metodikk for å produsere lentivirale PV basert på tre plasmider som nevnt her: (1) ryggradsplasmidet som bærer reportergenet som trengs for å overvåke infeksjonen; (2) emballasjeplasmidet som bærer genene for alle strukturelle proteiner som trengs for å generere PVene; (3) konvoluttoverflaten glykoprotein ekspresjonsplasmid som bestemmer virustropisme og medierer viral inngang i vertscellen. I dette arbeidet er SARS-CoV-2 Spike konvoluttglykoproteinet som brukes til produksjon av ikke-replikerende SARS-CoV-2 pseudotype lentivirus.
Kort fortalt ble pakkeceller (HEK293T) samtransfektet med de tre forskjellige plasmidene ved hjelp av standardmetoder. Etter 48 timer ble supernatanten som inneholdt PV-ene høstet, filtrert og lagret ved -80 °C. Smittsomheten til SARS-CoV-2 PV ble testet ved å studere ekspresjonen av reportergenet (luciferase) i en målcellelinje 48 timer etter infeksjon. Jo høyere verdien er for relative luminescensenheter (RLU), desto høyere er infeksjons-/transduksjonsraten. Videre ble de smittsomme PVene tilsatt de serielt fortynnede serumprøvene for å studere nøytraliseringsprosessen av pseudovirusets inntreden i målceller, målt som reduksjonen i RLU-intensitet: lavere verdier tilsvarende høy nøytraliserende aktivitet.
Pseudotypede virus (PV) er molekylære verktøy som brukes i mikrobiologi for å studere vertsvirus og patogen-patogen-interaksjoner 1,2,3,4. PV består av en indre del, den virale kjernen som beskytter virusgenomet, og en ytre del, konvoluttglykoproteinene på overflaten av viruset som definerer tropismen5. Et pseudovirus er replikasjonsinkompetent i målcellen fordi det ikke inneholder all genetisk informasjon for å generere nye viruspartikler. Denne kombinasjonen av særegne egenskaper gjør PV-er til et trygt alternativ til et villtypevirus. Wildtype-virus er derimot høypatogene og kan ikke brukes i BSL 2-laboratorier for analyse6.
Smittsomheten til PV kan overvåkes av et reportergen, som vanligvis koder for et fluorescerende protein (GFP, RFP, YFP) eller et enzym som produserer kjemiluminescerende produkter (luciferase). Dette er inneholdt i et av plasmidene som brukes til PV-produksjon og innlemmet i genomet til pseudovirus7.
Flere typer PV-kjerner eksisterer for tiden, inkludert lentiviral-avledede partikler basert på HIV-1-genomet. Den store fordelen med HIV-1-baserte PV over andre plattformer er deres iboende integrasjonsprosess i målcellegenomet8. Selv om HIV-1 er et svært smittsomt virus og er årsaken til AIDS, er disse lentivirale vektorene trygge å bruke på grunn av de omfattende optimaliseringstrinnene gjennom årene. Optimale sikkerhetsforhold ble oppnådd ved innføring av 2. generasjons lentivirale vektorer, hvor virusgener ble utarmet uten å påvirke transduksjonsevnen9. 3. og 4. generasjon bidro til økt sikkerhet ved lentiviral vektorhåndtering med ytterligere spalting av virusgenomet i separate plasmider10,11. De siste generasjonene av PV er vanligvis ansatt for å produsere lentivirale vektorer for genterapi.
PV kan brukes til å studere interaksjoner mellom virus og vertsceller, både under produksjons- og infeksjonsfasen. PV er spesielt ansatt i pseudovirus nøytralisering analyser (PVNA). PVNA er allment validert for å vurdere nøytraliseringspotensialet til serum eller plasma ved å målrette det virale glykoproteinet på PVs konvolutt12,13. Nøytraliseringsaktivitet, uttrykt som den hemmende konsentrasjonen 50 (IC50), er definert som fortynning av serum / plasma som blokkerer 50% av viral partikkelinngang14. I denne protokollen beskrev vi oppsett av PVNA for å teste antistoffaktiviteten mot Severe Acute Respiratory Syndrome – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i sera samlet inn før og etter oppfriskningsvaksinedose.
Selv om bruk av et villtypevirus simulerer den faktiske infeksjonen, er lentivirale PV et tryggere alternativ for å studere mekanismene forbundet med viral oppføring og infeksjon uten de strenge sikkerhetskravene som er nødvendige for å arbeide med patogene virus 4,20,21. PV er sammensatt av en replikasjonsdefekt viral kjerne omgitt av overflatekonvoluttglykoprotein av et patogent virus, som er målet med studien.
<p cla…The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner bidraget fra de frivillige helsearbeiderne. Dette prosjektet ble støttet av Department of Excellence 2023/2027, MUR, Italia. AR og DZ ble støttet av PRIN2022 (EU-midler; NextGenerationEU)
0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |