Determinação da atividade pró-coagulante de vesículas extracelulares (EV) utilizando o tempo de coagulação ativado por EV (EV-ACT)

Summary

Este protocolo investiga o uso de plasma rico em vesículas extracelulares (VE) como indicador da capacidade coagulativa da VE. O plasma rico em EV é obtido através de um processo de centrifugação diferencial e subsequente recalcificação.

Abstract

O papel das vesículas extracelulares (VE) em várias doenças vem ganhando atenção crescente, particularmente devido à sua potente atividade pró-coagulante. No entanto, há uma necessidade urgente de um teste à beira do leito para avaliar a atividade pró-coagulante da EV em ambientes clínicos. Este estudo propõe o uso do tempo de ativação da trombina do plasma rico em EV como medida da atividade pró-coagulante da EV. Procedimentos padronizados foram empregados para obtenção de sangue total citrato de sódio, seguido de centrifugação diferencial para obtenção de plasma rico em EV. O plasma rico em EV e o cloreto de cálcio foram adicionados à ventosa, e as mudanças na viscoelasticidade foram monitoradas em tempo real usando um analisador. O tempo natural de coagulação do plasma rico em EV, referido como EV-ACT, foi determinado. Os resultados revelaram um aumento significativo no EV-ACT quando EV foi removido do plasma obtido de voluntários saudáveis, enquanto diminuiu significativamente quando EV foi enriquecido. Além disso, EV-ACT foi consideravelmente encurtado em amostras humanas de pré-eclâmpsia, fratura de quadril e câncer de pulmão, indicando níveis elevados de EV plasmático e promoção de hipercoagulação sanguínea. Com seu procedimento simples e rápido, o EV-ACT mostra-se promissor como um teste à beira do leito para avaliar a função da coagulação em pacientes com altos níveis plasmáticos de EV.

Introduction

A trombose, causada pela hipercoagulabilidade, desempenha um papel significativo em várias doenças, incluindo traumatismo cranioencefálico¹, pré-eclâmpsia², tumores³ e pacientes fraturados⁴. O mecanismo subjacente à hipercoagulabilidade é complexo, e ênfase recente tem sido dada ao papel das vesículas extracelulares (VE) nos distúrbios de coagulação. EVs são corpos vesiculares com uma estrutura bicamada que se desprendem da membrana celular, variando em diâmetro de 10 nm a 1000 nm. Estão associados a uma variedade de processos patológicos, particularmente distúrbios de coagulação⁵. Vários estudos identificaram os EVs como um preditor promissor do risco de trombose ^6,7. A atividade pró-coagulante dos EVs depende da expressão de fatores de coagulação, principalmente fator tecidual (FT) e fosfatidilserina (PS). EVs com atividade pró-coagulante robusta aumentam significativamente a eficiência catalítica da tenase e do complexo protrombina, promovendo fibrinogênio mediado por trombina e trombose local⁸. Níveis elevados de EV e sua relação causal com a hipercoagulabilidade têm sido observados em inúmeras doenças⁹. Consequentemente, padronizar a detecção de EVs e relatar sua atividade pró-coagulante é uma importante área de investigação¹⁰.

Até o momento, apenas alguns kits comerciais estão disponíveis para detectar a atividade pró-coagulante dos EVs. O ensaio MP-Atividade e o ensaio MP-TF, produzidos por uma empresa comercial, são ensaios funcionais utilizados para medir a atividade pró-coagulante da EV no plasma¹¹. Esses ensaios empregam um princípio semelhante ao dos ensaios imunoenzimáticos para detectar PS e FT em EVs. No entanto, esses kits são caros e limitados a algumas instituições de pesquisa de alto nível. O processo é complexo e demorado, tornando desafiador implementá-los em ambientes clínicos. Além disso, um ensaio de fosfolipídios pró-coagulantes (PPL) desenvolvido comercialmente mistura plasma livre de PS com plasma teste, medindo o tempo de coagulação para detectar quantitativamente os níveis de EVs PS-positivos¹². No entanto, esses ensaios se concentram principalmente em PS e TF em EVs, ignorando outras vias de coagulação nas quais os EVs circulantes podem estar envolvidos¹².

O sistema de coagulação do plasma é intrincado e compreende componentes “invisíveis” e “visíveis”, incluindo coagulantes, anticoagulantes, sistemas fibrinolíticos e EVs suspensos no plasma. Fisiologicamente, esses componentes mantêm um equilíbrio dinâmico. Em condições patológicas, o aumento significativo dos VE na circulação contribui para a hipercoagulabilidade, particularmente em pacientes com traumatismo cranioencefálico, pré-eclâmpsia, fraturas e vários tipos de câncer¹³. Atualmente, a avaliação do estado de coagulação em laboratórios clínicos envolve principalmente a avaliação do sistema de coagulação, sistema de anticoagulação e fibrinólise 14,15,16,17. O tempo de protrombina, o tempo de tromboplastina parcial ativada, o tempo de trombina e a razão normalizada internacional são comumente utilizados para avaliar os níveis de fatores de coagulação no sistema de coagulação¹⁸. No entanto, estudos recentes têm revelado que esses testes não refletem totalmente a hipercoagulabilidade de certas doenças¹⁹. Outros métodos de ensaio, como a tromboelastometria (TEG), o TEG rotacional e a análise de sonoclots, medem as alterações viscoelásticas do sangue total^20,21. Uma vez que as amostras de sangue total contêm numerosas células sanguíneas e plaquetas, estes testes são mais susceptíveis de indicar o estado de coagulação da amostra como um todo. Alguns pesquisadores têm relatado o papel das células sanguíneas e plaquetas na atividade pró-coagulante^22,23. Um estudo recente também descobriu que testes prévios de função da coagulação enfrentam dificuldades em detectar alterações na atividade pró-coagulante das micropartículas²⁴. Portanto, foi proposta a hipótese de que a função pró-coagulante dos EVs pode ser avaliada por medidas viscoelásticas do tempo de coagulação ativado (TCA) em plasma rico em EV.

Protocol

A coleta de amostras humanas foi aprovada pelo Comitê de Ética Médica do Tianjin Medical University General Hospital. A coleta de sangue venoso humano seguiu rigorosamente a diretriz emitida pela Comissão Nacional de Saúde da China, ou seja, a Diretriz WS/T 661-2020 para Coleta de Amostras de Sangue Venoso. Resumidamente, o sangue foi coletado de indivíduos sadios com consentimento informado da veia da região anterior do braço, e as amostras foram misturadas com anticoagulante citrato de sódio a 3,2% na proporç…

Representative Results

O tempo de ativação da trombina do plasma rico em EV foi medido usando um analisador de método viscoelástico para medir o tempo de coagulação do plasma. A máquina é composta por quatro componentes principais: um conversor eletrônico de sinais, uma sonda, um tanque de detecção e um elemento de aquecimento (Figura 1A,B). A sonda utiliza oscilações de alta frequência e baixa amplitude para detectar mudanças na viscosidade do plasma. O controle de qualidade diári…

Discussion

Neste estudo, a preparação de plasma rico em EV foi descrita, e a racionalidade do método foi verificada por citometria de fluxo. Posteriormente, as amostras de plasma recalcificadas foram analisadas quanto ao tempo de TCA utilizando um analisador de coágulos baseado nos princípios de viscoelasticidade²⁴. Como mostrado na Figura 3A, a concentração de EVs obtidos por ultracentrifugação encurtou o tempo de EV-ACT, enquanto o sobrenadante após ultracentrifugaç…

Materials

AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.