Summary

ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

Published: January 26, 2024
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Summary

ここでは、自動細胞培養システムのプロトコールを紹介します。この自動培養システムは、iPS細胞の維持管理から各種細胞への分化まで、人工多能性幹細胞(iPS細胞)の取り扱いに不慣れな研究者など、ユーザーの手間を軽減し、メリットがあります。

Abstract

無限の自己増殖能力を持つヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、希少疾患の病態解明、新薬開発、損傷臓器の修復を目的とした再生医療など、多くの分野での応用が期待されています。しかし、iPS細胞の社会実装はまだまだ限定的です。これは、iPS細胞が微細な環境変化に対して高い感度を持つため、高度な知識や高度な技術をもってしても、培養における分化の再現が困難であることも一因です。自動培養システムの適用により、この問題を解決できます。研究者の技量によらず、再現性の高い実験が、各機関で共通の手順で実施されることが期待されます。iPS細胞の培養を維持し、分化を誘導できる自動培養システムはこれまでにもいくつか開発されていますが、これらのシステムは、ヒト化された多関節ロボットアームを使用するため、重く、大きく、コストがかかります。上記の課題を改善すべく、シンプルなX-Y-Z軸スライドレール方式を採用し、小型・軽量・安価化を実現した新システムを開発しました。さらに、ユーザーは新しいシステムのパラメータを簡単に変更して、新しい処理タスクを開発することができます。タスクが決まれば、あとはiPS細胞を準備し、目的のタスクに必要な試薬や消耗品を事前に用意し、タスク番号を選択し、時間を指定するだけです。このシステムにより、iPS細胞をフィーダー細胞を使わずに数回継代で未分化状態に維持し、心筋細胞、肝細胞、神経前駆細胞、ケラチノサイトなど様々な細胞種に分化できることを確認しました。これにより、熟練した研究者を必要とせず、施設間で再現性の高い実験が可能となり、新規参入の障壁が減り、より幅広い研究分野でのiPS細胞の社会実装が促進されます。

Introduction

本稿では、企業と共同で作製したヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の自動培養システムについて、実際の詳細な取り扱い手順と代表的な成果を示すことを目的としています。

2007年の論文発表以来、iPS細胞は世界中で注目を集めています1。あらゆる体細胞に分化できるという最大の特徴から、再生医療、難治性疾患の原因解明、新規治療薬の開発など、さまざまな分野への応用が期待されています2,3。また、ヒトiPS細胞由来の体細胞を用いることで、倫理的制約の大きい動物実験を減らすことができます。iPS細胞を用いた新しい方法の研究には、常に多くの均質なiPS細胞が必要ですが、その管理は手間がかかります。また、iPS細胞は感度が高いため、微妙な文化や環境の変化にも敏感に反応するため、取り扱いが困難です。

この問題を解決するために、自動化された培養システムが人間の代わりにタスクを実行することが期待されています。いくつかのグループは、細胞の維持と分化のためのいくつかの自動化されたヒト多能性幹細胞培養システムを開発し、その成果を発表しました4,5,6。これらのシステムは、多関節ロボットアームを装備しています。ロボットアームは、人間の腕の動きを高度に模倣するというメリットがあるだけでなく、アームのコストが高く、システムのパッケージングが大きくて重く、目的の動きを得るためにエンジニアの教育に時間がかかるというデメリットもあります7,8。経済的、スペース的、人的資源の消費の点で、より多くの研究施設に装置を導入しやすくするために、iPS細胞を様々な細胞種に維持・分化するための新しい自動培養システムを開発しました9

新しいシステムの理論的根拠は、多関節ロボットアーム9の代わりにX-Y-Z軸レールシステムを採用することでした。ロボットアームの複雑な手のような機能を置き換えるために、3種類の特定の機能アームの先端を自動的に変更できるという新しいアイデアを適用しました。また、ここでは、プロセス全体を通してエンジニアの貢献が要求されないため、ユーザーがソフトウェア上で簡単な注文でタスクスケジュールを簡単に作成できることも示します。

ロボット培養システムの1つでは、96ウェルプレートを分化のための3D細胞凝集体として使用して胚様体を作ることを実証しました4。ここで報告するシステムでは、96 ウェルプレートを処理できません。1つは、ヒト多能性幹細胞ではなかったが、細胞株を用いて現在の適正製造基準(cGMP)グレードを達成した5。ここで詳述する自動培養システムは、実験室での実験を支援することを特に目的として開発されました(図1)。但しそれはレベルIVの安全キャビネットと同等のきれいなレベルを保つ十分なシステムを有する。

Protocol

関西医科大学倫理委員会は、KMUR001と名付けられた健康なボランティア由来iPS細胞の作製と使用を承認しました(承認番号2020197)。公然と募集されたドナーは、正式なインフォームドコンセントを提供し、細胞の科学的使用に同意しました。 メモ: 現在のインターフェイス(Windows XPオペレーティングシステムで実行されている「ccssHMI」という名前の特別なソフトウェア)は、?…

Representative Results

ヒト人工多能性幹細胞の維持3系統(理研-2F、253G1、KMUR001)を用いた。日々の手作業による実験でメンテナンスプロトコルを最適化し、さらにシステムによる7回の予備実験で詳細なプログラムを最適化しました。たとえば、人間とシステムが扱う異なるピペットからのスピットフローの液体速度によって引き起こされるせん断応力は大きく異なります。そこで、酵素消化の時間の…

Discussion

プロトコルの重要なステップは、ユーザーが障害を見つけた場合、いつでもキャンセル、停止、またはリセットボタンをクリックして、最初のステップからやり直すことです。このソフトウェアは、ダブルブッキング、システムタスクがアクティブなときにドアを開ける、補充の欠如などの人為的ミスを回避できます。目的の体細胞への分化を成功させ、効率的に行うためのもう一つの重要?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究は、パナソニックプロダクションエンジニアリング株式会社(大阪市)新事業推進センターからの助成金を受けて行われました。

Materials

0.15% bovine serum albumin fraction V Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan 9048-46-8
1% GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
10 cm plastic plates  Corning Inc., NY, United States 430167
253G1 RKEN Bioresource Research Center HPS0002
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
Actinin  mouse Abcam ab9465
Activin A  Nacali Tesque 18585-81
Adenine Thermo Fisher Scientific A14906.30
Albumin  rabbit Dako A0001
All-trans retinoic acid Fuji Film Wako Chemical Inc.  186-01114
Automated culture system Panasonic
B-27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
bFGF Fuji Film Wako Chemical Inc.  062-06661
BMP4  Thermo Fisher Scientific PHC9531
Bovine serum albumin Merck 810037
CHIR-99021  MCE, NJ, United States #HY-10182 252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM Thermo Fisher Scientific 10744019 Human keratinocyte medium
Dexamethasone Merck 266785
Dihexa  TRC, Ontario, Canada 13071-60-8 rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific C10228
Dorsomorphin Thermo Fisher Scientific 1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12  Fuji Film Wako Chemical Inc. 12634010
EGF Fuji Film Wako Chemical Inc.  053-07751
Essential 8  Thermo Fisher Scientific A1517001 Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum  Biowest, FL, United States S140T
FGF-basic  Nacalai Tesque Inc. 19155-07
Forskolin Thermo Fisher Scientific J63292.MF
Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081 Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 Thermo Scientific A11056
HNF-4A  goat Santacruz 6556
Hydrocortisone Thermo Fisher Scientific A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate Merck H2882
iMatrix511 Silk  Nippi Inc., Tokyo, Japan 892 021 Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium Thermo Fisher Scientific 41400045
Keratin 1  mouse Santacruz 376224
Keratin 10  rabbit BioLegend 19054
KMUR001 Kansai Medical University  Patient-derived iPSCs 
Knockout serum replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate  A8960, Merck A8960
Leibovitz’s L-15 medium  Fuji Film Wako Chemical Inc. 128-06075
Matrigel Corning Inc. 354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 Thermo Scientific A21202
N-2 supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
Nestin mouse Santacruz 23927
Neurobasal medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Neurofilament  rabbit Chemicon AB1987
Neutristem Sartrius AG, Göttingen, Germany 05-100-1A cell culture medium 
Oct 3/4  mouse BD 611202
PBS(-) Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan 14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 Thermo Scientific A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 Thermo Scientific A10040
Recombinant human albumin  A0237, Merck, Darmstadt, Germany A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632  Sellec Inc., Tokyo, Japan 129830-38-2
RIKEN 2F RKEN Bioresource Research Center HPS0014 undifferentiated hiPSCs 
RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific #11875 12633020
SB431542 Thermo Fisher Scientific 301836-41-9
Sodium L-ascorbate Merck A4034-100G
SSEA-4  mouse Millipore MAB4304
StemFit AK02N  Ajinomoto, Tokyo, Japan AK02 cell culture medium 
TnT rabbit Abcam ab92546
TRA 1-81 mouse Millipore MAB4381
Triiodothyronine Thermo Fisher Scientific H34068.06
TripLETM express enzyme  Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States 12604013
Trypan blue solution  Nacalai Tesque, Kyoto, Japan 20577-34
Tryptose phosphate broth Merck T8782-500G
Wnt-C59  Bio-techne, NB, United Kingdom 5148
β Equation 1 Tublin  mouse Promega G712A

References

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Cite This Article
Bando, K., Yamashita, H., Hattori, F. An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (203), e65672, doi:10.3791/65672 (2024).

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