نظام استزراع آلي للحفاظ على الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وتمييزها
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لنظام زراعة الخلايا الآلي. يقلل نظام الاستزراع الآلي هذا من العمالة ويفيد المستخدمين ، بما في ذلك الباحثين غير المعتادين على التعامل مع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) ، من صيانة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا.
Abstract
من المتوقع أن يكون للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) ذات القدرة اللانهائية على التكاثر الذاتي تطبيقات في العديد من المجالات ، بما في ذلك توضيح أمراض الأمراض النادرة ، وتطوير أدوية جديدة ، والطب التجديدي الذي يهدف إلى استعادة الأعضاء التالفة. على الرغم من ذلك ، لا يزال التنفيذ الاجتماعي ل hiPSCs محدودا. ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة إعادة إنتاج التمايز في الثقافة ، حتى مع المعرفة المتقدمة والمهارات التقنية المتطورة ، بسبب الحساسية العالية ل iPSCs للتغيرات البيئية الدقيقة. يمكن أن يؤدي تطبيق نظام الثقافة الآلي إلى حل هذه المشكلة. يمكن توقع تجارب ذات قابلية استنساخ عالية مستقلة عن مهارة الباحث وفقا لإجراء مشترك عبر مختلف المعاهد. على الرغم من أن العديد من أنظمة الاستزراع الآلي التي يمكنها الحفاظ على ثقافات iPSC وتحفيز التمايز قد تم تطويرها سابقا ، إلا أن هذه الأنظمة ثقيلة وكبيرة ومكلفة لأنها تستخدم أذرعا روبوتية إنسانية متعددة المفاصل. لتحسين المشكلات المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير نظام جديد باستخدام نظام سكة منزلق بسيط للمحور x-y-z ، مما يسمح له بأن يكون أكثر إحكاما وأخف وزنا وأرخص. علاوة على ذلك ، يمكن للمستخدم بسهولة تعديل المعلمات في النظام الجديد لتطوير مهام معالجة جديدة. بمجرد إنشاء المهمة ، كل ما يحتاجه المستخدم هو إعداد iPSC ، وتوفير الكواشف والمواد الاستهلاكية اللازمة للمهمة المطلوبة مسبقا ، وتحديد رقم المهمة ، وتحديد الوقت. أكدنا أن النظام يمكنه الحفاظ على iPSCs في حالة غير متمايزة من خلال عدة ممرات بدون خلايا مغذية والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك خلايا عضلة القلب وخلايا الكبد والأسلاف العصبية والخلايا الكيراتينية. سيمكن النظام من إجراء تجارب قابلة للتكرار بدرجة كبيرة عبر المؤسسات دون الحاجة إلى باحثين مهرة وسيسهل التنفيذ الاجتماعي ل hiPSCs في مجموعة واسعة من مجالات البحث من خلال تقليل العقبات التي تحول دون الدخول الجديد.
Introduction
تهدف هذه المقالة إلى توفير إجراءات معالجة فعلية ومفصلة لنظام زراعة آلي للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) ، والتي أنتجناها بالتعاون مع شركة ، وإظهار نتائج تمثيلية.
منذ نشر المقال في عام 2007 ، جذبت iPSC الانتباه في جميع أنحاء العالم1. نظرا لأعظم ميزة لها تتمثل في القدرة على التمايز إلى أي نوع من الخلايا الجسدية ، فمن المتوقع أن يتم تطبيقها في مجالات مختلفة مثل الطب التجديدي ، وتوضيح أسباب الأمراض المستعصية ، وتطوير أدوية علاجية جديدة 2,3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الخلايا الجسدية البشرية المشتقة من iPSC يمكن أن يقلل من التجارب على ، والتي تخضع لقيود أخلاقية كبيرة. على الرغم من أن العديد من iPSCs المتجانسة مطلوبة باستمرار للبحث عن طرق جديدة مع iPSCs ، إلا أن إدارتها شاقة للغاية. علاوة على ذلك ، فإن التعامل مع iPSC أمر صعب بسبب حساسيته العالية ، حتى للتغيرات الثقافية والبيئية الدقيقة.
لحل هذه المشكلة ، من المتوقع أن تؤدي أنظمة الثقافة الآلية المهام بدلا من البشر. طورت بعض المجموعات عددا قليلا من أنظمة زراعة الخلايا الجذعية البشرية الآلية متعددة القدرات لصيانة الخلايا والتمايز ونشرت إنجازاتها4،5،6. تجهز هذه الأنظمة ذراعا (أذرع) روبوتية متعددة المفاصل. لا تتمتع الأذرع الروبوتية بميزة من حيث أنها تحاكي حركات الذراع البشرية فحسب ، بل إنها أيضا تعيب من حيث أنها تتطلب تكلفة (تكاليف) أعلى للذراع (الذراعات) ، وتغليف نظام أكبر وأثقل ، وجهود تعليمية تستغرق وقتا طويلا من قبل المهندسين للحصول على الحركات المستهدفة 7,8. من أجل تسهيل إدخال الجهاز إلى المزيد من المرافق البحثية في نقاط الاستهلاك الاقتصادي والمساحي والموارد البشرية ، قمنا بتطوير نظام ثقافة آلي جديد لصيانة وتمييز iPSC إلى أنواع مختلفة من الخلايا9.
كان الأساس المنطقي للنظام الجديد هو اعتماد نظام سكة حديد المحور X-Y-Z بدلا من الأذرع الروبوتية متعددة المفاصل9. لاستبدال الوظائف المعقدة الشبيهة باليد للأذرع الروبوتية ، قمنا بتطبيق فكرة جديدة على هذا النظام ، والتي يمكنها تلقائيا تغيير ثلاثة أنواع من أطراف الذراع الوظيفية المحددة. هنا ، نشير أيضا إلى كيف يمكن للمستخدمين بسهولة عمل جداول المهام بأوامر بسيطة على البرامج بسبب عدم وجود متطلبات لمساهمات المهندسين طوال العملية.
أظهر أحد أنظمة الاستزراع الروبوتي صنع أجسام جنينية باستخدام 96 لوحة بئر كمجاميع خلايا ثلاثية الأبعاد للتمايز4. لا يمكن للنظام المذكور هنا التعامل مع 96 لوحة بئر. حقق أحدهما درجة ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) باستخدام خط الخلية ، على الرغم من أنها لم تكن خلية جذعية بشرية متعددة القدرات5. تم الآن تطوير نظام الاستزراع الآلي المفصل هنا بهدف محدد هو مساعدة التجارب المعملية (الشكل 1). ومع ذلك ، فإنه يحتوي على أنظمة كافية للحفاظ على مستويات نظيفة تعادل خزانة أمان من المستوى الرابع.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتمثل إحدى الخطوات المهمة في البروتوكول في أنه إذا وجد المستخدم أي أخطاء ، فانقر فوق الزر “إلغاء” أو “إيقاف” أو “إعادة تعيين” في أي وقت وابدأ من جديد من الخطوة الأولى. يمكن للبرنامج تجنب الأخطاء البشرية ، بما في ذلك الحجز المزدوج ، وفتح الأبواب أثناء تنشيط مهام النظام ، ونقص التجديد. نقطة أخرى…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بمنحة من مركز ترويج الأعمال الجديدة ، شركة باناسونيك لهندسة الإنتاج المحدودة ، أوساكا ، اليابان.
Materials
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
β  Tublin mouse |
Promega | G712A |
References
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn’t anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
