ここでは、自動細胞培養システムのプロトコールを紹介します。この自動培養システムは、iPS細胞の維持管理から各種細胞への分化まで、人工多能性幹細胞(iPS細胞)の取り扱いに不慣れな研究者など、ユーザーの手間を軽減し、メリットがあります。
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この記事について
サマリー
要約
無限の自己増殖能力を持つヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、希少疾患の病態解明、新薬開発、損傷臓器の修復を目的とした再生医療など、多くの分野での応用が期待されています。しかし、iPS細胞の社会実装はまだまだ限定的です。これは、iPS細胞が微細な環境変化に対して高い感度を持つため、高度な知識や高度な技術をもってしても、培養における分化の再現が困難であることも一因です。自動培養システムの適用により、この問題を解決できます。研究者の技量によらず、再現性の高い実験が、各機関で共通の手順で実施されることが期待されます。iPS細胞の培養を維持し、分化を誘導できる自動培養システムはこれまでにもいくつか開発されていますが、これらのシステムは、ヒト化された多関節ロボットアームを使用するため、重く、大きく、コストがかかります。上記の課題を改善すべく、シンプルなX-Y-Z軸スライドレール方式を採用し、小型・軽量・安価化を実現した新システムを開発しました。さらに、ユーザーは新しいシステムのパラメータを簡単に変更して、新しい処理タスクを開発することができます。タスクが決まれば、あとはiPS細胞を準備し、目的のタスクに必要な試薬や消耗品を事前に用意し、タスク番号を選択し、時間を指定するだけです。このシステムにより、iPS細胞をフィーダー細胞を使わずに数回継代で未分化状態に維持し、心筋細胞、肝細胞、神経前駆細胞、ケラチノサイトなど様々な細胞種に分化できることを確認しました。これにより、熟練した研究者を必要とせず、施設間で再現性の高い実験が可能となり、新規参入の障壁が減り、より幅広い研究分野でのiPS細胞の社会実装が促進されます。
概要
本稿では、企業と共同で作製したヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の自動培養システムについて、実際の詳細な取り扱い手順と代表的な成果を示すことを目的としています。
2007年の論文発表以来、iPS細胞は世界中で注目を集めています1。あらゆる体細胞に分化できるという最大の特徴から、再生医療、難治性疾患の原因解明、新規治療薬の開発など、さまざまな分野への応用が期待されています2,3。また、ヒトiPS細胞由来の体細胞を用いることで、倫理的制約の大きい動物実験を減らすことができます。iPS細胞を用いた新しい方法の研究には、常に多くの均質なiPS細胞が必要ですが、その管理は手間がかかります。また、iPS細胞は感度が高いため、微妙な文化や環境の変化にも敏感に反応するため、取り扱いが困難です。
この問題を解決するために、自動化された培養システムが人間の代わりにタスクを実行することが期待されています。いくつかのグループは、細胞の維持と分化のためのいくつかの自動化されたヒト多能性幹細胞培養システムを開発し、その成果を発表しました4,5,6<....
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プロトコル
関西医科大学倫理委員会は、KMUR001と名付けられた健康なボランティア由来iPS細胞の作製と使用を承認しました(承認番号2020197)。公然と募集されたドナーは、正式なインフォームドコンセントを提供し、細胞の科学的使用に同意しました。
メモ: 現在のインターフェイス(Windows XPオペレーティングシステムで実行されている「ccssHMI」という名前の特別なソフトウェア)は、基本的な操作画面です。前述のインターフェイスの下には、一連のタブが配置されており、ユーザーはさまざまな操作を開始できます。
1. ローディング作業
- ソフトウェアのトップ画面にある [読み込み 中]ボタンをクリックします。「 Loading Preparation Start 」ボタンをクリックします。
- 装置に入れる皿またはプレートを装置内の所定の位置に置きます。
注意: 皿の識別に必要な情報は、各蓋に記入する必要があります。 - フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。
- ソフトウェアで料理またはプレートの種類と数量を選択します。
- 「 Loading Preparation Completed ....
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結果
ヒト人工多能性幹細胞の維持
3系統(理研-2F、253G1、KMUR001)を用いた。日々の手作業による実験でメンテナンスプロトコルを最適化し、さらにシステムによる7回の予備実験で詳細なプログラムを最適化しました。たとえば、人間とシステムが扱う異なるピペットからのスピットフローの液体速度によって引き起こされるせん断応力は大きく異なります。そこで、酵素消化の時間の長さと、システムによる細胞分散のためのピペッティング回数を最適化しました。
ヒト人工多能性幹細胞を、0.5 μg/cm2 細胞培養マトリックスでコーティングした 10 cm のディッシュと iPS細胞培養培地 (Neutristem や StemFit AK02N など) で維持しました。継代については、5 mLのカルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS[-])でhiPS細胞を3回洗浄し、次に3 mLのTrypLE Express酵素に10 μMのRhoキナーゼ阻害剤(Y-27632)を添加して37°Cで15分間処理するようにプログラムしました。 その後、.......
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ディスカッション
プロトコルの重要なステップは、ユーザーが障害を見つけた場合、いつでもキャンセル、停止、またはリセットボタンをクリックして、最初のステップからやり直すことです。このソフトウェアは、ダブルブッキング、システムタスクがアクティブなときにドアを開ける、補充の欠如などの人為的ミスを回避できます。目的の体細胞への分化を成功させ、効率的に行うためのもう一つの重要なポイントは、各多能性幹細胞がその分化特性に制御不能なバイアスを持っているため、多能性幹細胞株の適切な選択である14,15。
人工多能性幹細胞の自動培養システムは、多能性幹細胞を維持し、様々な体細胞タイプに分化させることができます。このシステムのサイズは、幅200cm、奥行き110cm、高さ233cmで、総重量は1.2トンです。装置に内蔵されたインキュベーターは、36枚の10cm皿と9枚のマルチウェルプレートを同時に保持することができます。
従来機から改良されたのは、.......
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
本研究は、パナソニックプロダクションエンジニアリング株式会社(大阪市)新事業推進センターからの助成金を受けて行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.15% ウシ血清アルブミン画分 V | 富士フイルム和光化学工業株式会社, 宮崎 | , 日本 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm プラスチックプレート | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin マウス | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin ウサギ | Dako | A0001 | |
| All-trans Retinoic acid | 富士フイルム 和光化学工業 | 186-01114 | |
| 全自動培養システム | パナソニック | ||
| B-27サプリメント | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 17504044 | |
| bFGF | 富士フイルム和光化学工業株式会社 | 062-06661 | |
| BMP4 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | PHC9531 | |
| ウシ血清アルブミン | メルク | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC、オンタリオ州、カナダ | 13071-60-8 | rac-1,2-ジヘキサデシルグリセロール |
| 使い捨て血球計算盤 | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco's モディファイドイーグルミディアム/F12 | 富士フイルム和光ケミカル株式会社 | ||
| EGF | 富士フイルム和光化学工業(株) | 053-07751 | |
| エッセンシャル 8 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A1517001 | ヒト多能性幹細胞培地 |
| ウシ胎児血清 | Biowest、FL、米国 | S140T | |
| FGF-basic | ナカライテスク株式会社 | 19155-07 | |
| Forskolin | サーモフィッシャーサイエンティフィック | J63292。 | |
| グルタミン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25030081 | グルタミンサプリメント |
| ヤギ IgG(H+L) AlexaFluo546 | サーモサイエンティフィック | A11056 | |
| HNF-4A ヤギ | サンタクルス | 6556 | |
| ヒドロコルチゾン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A16292.06 | |
| ヒドロコルチゾン 21-ヘミスコハク酸 | メルク | H2882 | |
| iMatrix511 シルク | ニッピ株式会社 | 892 021 | 細胞培養マトリックス |
| インスリントランスフェリンセレン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 41400045 | |
| ケラチン 1 マウス | サンタクルス | 376224 | |
| ケラチン 10 KMUR001; ウサギ | BioLegend | 19054 | |
| 関西 | 医科大学 | 患者由来iPS細胞 | |
| ノックアウト血清補充 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10828010 | |
| L-アスコルビン酸 2-リン酸 | A8960、メルク | A8960 | |
| リーボビッツ's L-15 ミディアム | 富士フイルム和光ケミカル株式会社 | 128-06075 | |
| マトリゲル | コーニング株式会社 | ||
| マウス IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific Scientific 17502048 | ||
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| ニュートリステム | ・サルトリウスAG、Göttingen, Germany | 05-100-1A | 細胞培養培地 |
| 10月3/4 マウス | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| 組換えヒトアルブミン | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rhoキナーゼ阻害剤, Y-27632 | 株式会社セレック | 〒129830-38-2 | |
| 理化学研究所 2階 | RKEN バイオリソース研究センター | HPS0014 | 未分化 iPS細胞 |
| RPMI 1640 | サーモフィッシャーサイエンティフィック#11875 | 12633020 | |
| SB431542 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 301836-41-9 | |
| L-アスコルビン酸ナトリウム | メルク | A4034-100G | |
| SSEA-4 マウス | ミリポア | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | 味の素、東京、日本 | AK02 | 細胞培養液 |
| TnT ウサギ | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 マウス | ミリポア | MAB4381 | |
| トリヨードチロニン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | H34068.06 | |
| TripLETM 発現酵素 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| トリパンブルー溶液 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| リン酸トリプトースブロス | メルク | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne、NB、イギリス | 5148 | |
&ベータ;  チューブリン マウス | Promega | G712A |
参考文献
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induce....
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