Här presenterar vi ett protokoll för att odla specifika hypotalamuscellsubtyper i odling. Cellerna kan väljas ut baserat på lämpliga/unika membranmarkörer och användas i många applikationer, inklusive immunofluorescens, elektrofysiologiska och biokemiska analyser.
Hypotalamus reglerar grundläggande metaboliska processer genom att kontrollera funktioner så varierande som matintag, kroppstemperatur och hormonfrisättning. Eftersom hypotalamus funktioner styrs av specifika undergrupper av neuronala populationer, ger förmågan att isolera dem ett viktigt verktyg för att studera metaboliska mekanismer. I detta avseende utgör hypotalamus neuronala komplexitet exceptionella utmaningar.
Av dessa skäl har nya tekniker, såsom Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS), utforskats. Denna artikel beskriver en ny tillämpning av magnetaktiverad cellsortering (MACS) med hjälp av mikropärlteknik för att isolera en riktad neuronal population från prenatala mösshjärnor. Tekniken är enkel och garanterar en mycket ren och livskraftig primär hypotalamisk neuronkultur med hög reproducerbarhet. Hypotalamus dissocieras försiktigt, neuroner isoleras selektivt och separeras från gliaceller, och slutligen, med hjälp av en specifik antikropp för en cellytemarkör, väljs den intressanta populationen.
När de väl har isolerats kan riktade neuroner användas för att undersöka deras morfologiska, elektriska och endokrina egenskaper och deras svar under normala eller patologiska tillstånd. Dessutom, med tanke på hypotalamus olika roller för att reglera matning, ämnesomsättning, stress, sömn och motivation, kan en närmare titt på riktade och regionspecifika neuroner ge insikt i deras uppgifter i denna komplexa miljö.
Hypotalamus är ett mångsidigt område i hjärnan som förmedlar endokrina, autonoma, viscerala och beteendemässiga funktioner, inklusive matning, ämnesomsättning, sömn, kroppstemperatur, socialt beteende och sexlust 1,2,3,4,5. Funktionell heterogenitet uppnås genom en synergistisk kombination av biokemiska och elektriska mekanismer: hypotalamiska neuroner avfyrar aktionspotentialer och utsöndrar och frigör hormoner och neuropeptider för att modulera hjärnregioner och organ i kroppen. Slutligen översätter hypotalamus neuroner homeostatiska meddelanden från kroppen och svarar med långsiktig och kortsiktig feedback och feedforward-regleringar6.
Den komplexa neuronala miljön i hypotalamus inkluderar magnocellulära endokrina neuroner, som frigör oxytocin och vasopressin; parvocellulära nervceller, som främst är involverade i den systemiska hormonregleringen, frisätter till exempel tyreotropinfrisättningshormon (TRH) och kortikotropinfrisättningshormon (CRH) till hypofysen; stora peptiderga projektionsneuroner, frisättning av orexin och melaninkoncentrerande hormon (MCH); och parvocellulära peptiderga neuroner i Arcuate Nucleus (ARC) som frisätter POMC (proopiomelanocortin) och AgRP (agouti-relaterat protein), benämnda ARCPOMC respektive ARCAgRP. Tillsammans med sekretoriska celler är andra excitatoriska och hämmande neuroner, inklusive dopaminerga, glutaminerga och GABAerga neuroner 7, involverade i att bilda intrahypotalamus och extrahypotalamus kretsar, vilket skapar storskaliga samordnade nätverk av betydande cellulär heterogenitet8.
Hypotalamisk mångfald har varit en utmaning som forskare har försökt övervinna under de senaste 50 åren. För att studera denna heterogenitet i utvecklande, mogen och åldrande hypotalami har forskare å ena sidan använt encells-RNA-sekvensering för att utforska neuronal organisation, såväl som molekylära och transkriptomiska signaturer. Denna ansträngning har gett en insiktsfull inblick i de olika rollerna för hypotalamus neuroner och har tagit upp kopplingar mellan cellulär identitet och dess möjliga roll i det fysiologiska systemet 8,9,10. Å andra sidan har neuronala funktioner undersökts genom optogenetiska manipulationer och fiberfotometribeteendemetoder, vilket ger en närmare titt på kretsstrukturen. Under de senaste två decennierna har Cre-recombinas-tekniken gjort det möjligt för forskare att ontogenetiskt stimulera eller hämma en riktad grupp av neuroner samtidigt som de observerar förändringar i beteenden och kroppsreaktioner 6,11,12.
Dessa tillvägagångssätt undersöker dock hypotalamiska funktioner ur ett generellt perspektiv utan att dyka djupare in i de specifika cellulära mekanismerna eller den biologiska grunden för deras roll i den komplexa hypotalamusmiljön. För att ta itu med detta har mycket få studier fokuserat på att undersöka molekylära, biokemiska och elektriska egenskaper med hjälp av heterogena primära hypotalamuskulturer. Dessa studier syftade till att dissekera specifika neuronala processer i en komplex miljö och genererade integrativa modeller av fysiologiska mekanismer13,14,15. Icke desto mindre innebär icke-specifika kulturer betydande utmaningar. Till exempel störs neuronernas fysiologiska konnektivitet och anatomiska distribution av plätering av neuroner från olika hypotalamusregioner som normalt inte skulle interagera, vilket skapar förväxlingseffekter. Dessutom har varje region olika roller och brokiga neuronala populationer, vilket gör det svårt att studera enkla biologiska processer.
För att ta itu med dessa utmaningar har nya metoder under det senaste decenniet implementerats för att isolera neuroner av intresse, såsom immunpanorering, fluorescerande-aktiverad-cellsortering (FACS) och magnetisk-aktiverad-cellsortering (MACS). Immunpanorering är en strategi som används för att rena målceller med hjälp av antikroppsbelagda skålar för en serie icke-neuronala (negativa) och neuronala (positiva) urval. Även om denna teknik i princip skulle kunna generera högavkastande renade cellkulturer, används den i praktiken mest för astrocyter och oligodendrocyter eftersom dessa celler kan motstå timmar av manipulation16,17. FACS-tekniken är ett kraftfullt verktyg för att sortera celler baserat på fluorescerande markörer och cellulära egenskaper med hjälp av flödescytometri18,19,20. Mycket få studier använde dock denna metod för att isolera celler för cellodling. Tekniken är dyr och kräver högkvalificerad personal för att använda och underhålla; Dessutom är det en utmaning att upprätthålla livskraftiga och sterila celler i slutet av sorteringsproceduren21. Sammantaget verkar MACS vara en enkel, icke-dyr teknik för att erhålla mycket rena och livskraftiga kulturer av hypotalamus primära neuroner. Metoden använder magnetiska kulor som är kopplade till cellerna via en antikropp. Detta gör att cellerna kan isoleras med hjälp av kolonnens magnetfält.
Här beskriver vi en metod baserad på MACS-teknik, som vanligtvis används med kortikala nervceller. Detta protokoll gör det möjligt att i princip isolera livskraftiga och mycket rena hypotalamusneuroner. I denna studie förbereder vi primära kulturer av neuroner som uttrycker Leptinreceptorn (LepR), såsom ARCPOMC och ARCAgRP-neuroner , som endast finns i Arcuate Nucleus. Dessa nervceller reagerar på leptin, ett anorexigent hormon som utsöndras av fettvävnaden, på biokemiska och elektriska sätt. Därför möjliggör isoleringen av denna grupp av neuroner i odling studier av deras hormonella, metaboliska och elektriska egenskaper in vitro.
Att undersöka de biokemiska och elektriska egenskaperna hos hypotalamus neuroner är nyckeln till att förstå den molekylära grunden för metabolism, termoreglering, humörhantering, ätbeteende och mer. Den neuronala heterogeniteten hos hypotalamus gör dock detta arbete utmanande, och metoder för att isolera och studera specifika hypotalamus subpopulationer behövs.
In vivo-tekniker använder CRE-rekombinas, optogenetisk, fiberfotometri och kalciumavbildning. Dessa tillvägagångssätt möjliggör främst studier av de elektriska egenskaperna hos hypotalamus neuroner, och mycket få metoder finns för närvarande tillgängliga för att undersöka deras icke-elektriska egenskaper. MACS-tekniken som utvecklats i denna studie kan ge en teknik som är mottaglig för att isolera specifika hypotalamus neuronala subpopulationer in vitro, vilket möjliggör riktade behandlingar och analyser. Neuronala kulturer är enklare att hantera jämfört med samkulturer av olika neuronala populationer. Dessutom undviker renkulturer förväxlingseffekter som härrör från närvaron av glia och mikroglia. Således kunde neuroner från samma hypotalamusregion och typ studeras som svar på specifika metaboliska och hormonella insatser.
I detta protokoll valde vi hypotalamiska neuroner som uttrycker LepR. Isolerade LepR+-celler odlades för att undersöka deras cellulära, morfologiska och molekylära egenskaper som är svåra att studera in vivo. Kulturernas renhet var 99 %, vilket stöder metodens noggrannhet. Dessutom var LepR+-cellerna friska och livskraftiga vid DIV7 fram till DIV21.
Denna teknik har dock vissa begränsningar. E18 eller äldre rena neuronkulturer är utmanande att upprätthålla. Därför är extraktionsfönstret begränsat till E14-E16. Detta innebär att cellulära förändringar som uppstår efter E16 missas. Till exempel ökar uttrycket av leptinreceptorn i ARC-neuroner under den tidiga postnatala perioden22. Proceduren för isoleringen måste utföras så snabbt som möjligt för att minska cellulär stress och död och förbättra avkastningen. Proceduren kan ta upp till 5 timmar; Därför är det viktigt att upprätthålla sterila förhållanden och minska manipulationen till ett minimum. Det positiva urvalet kan leda till låg avkastning på grund av de låga mängderna tillgänglig vävnad, vilket begränsar antalet experiment som kan utföras med ett enda preparat. Förhöjd neuronal död observerades, troligen på grund av låg celltäthet och minskad neuronal konnektivitet och intraneuronalt stöd.
Dessutom måste den antikropp som riktar sig mot antigenet av intresse binda till cellytan för att garantera en korrekt separation. Vanligtvis är antikroppar som används för flödescytometri lämpliga för MACS-tekniken. Om antikroppen inte har använts tidigare i cellseparationsmetoder behövs validerings- och titreringsexperiment för att bestämma den ideala användningen och koncentrationen. Extraktionen av målceller kräver en cellytemarkör. Här använde vi en biotinylerad antikropp men i princip kunde även antikroppar konjugerade med andra molekyler, såsom FITC (fluoresceinisotiocyanat) och PE (renat antikvariat), användas. MACS-tekniken kan också tillämpas på nervceller som uttrycker en fluorofor, såsom GFP eller ett annat Tag-protein, vilket kan öka specificiteten och utbytet. Om en fluorofor inte används skulle alternativet vara att bekräfta uttrycket av den aktuella molekylen genom immunofluorescens innan experiment med levande celler utförs. Framtida studier kommer att testa giltigheten av dessa alternativ.
En viktig aspekt som denna studie inte tog upp gäller “troheten” hos de subneuronala populationerna. Vi konstaterade att de odlade LepR+-neuronerna uttryckte POMC, vilket är en signatur för nativaARC POMC-neuroner . Fler tester kommer dock att behövas för att dra slutsatsen att LepR+ neuronala kulturer rekapitulerar sina inhemska in vivo-motsvarigheter . Sammantaget kan MACS neuronala isoleringsprotokoll som presenteras här ge en giltig och effektiv metod för att studera in vitro hypotalamusmekanismer som annars skulle vara svåra att undersöka in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Grafiska figurer skapades med BioRender.com. Detta arbete stöddes av ett NIA-anslag (R01AG060919) och ett NSF-anslag (2030348) till FS.
Embryo extraction | |||
1 curved point forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | Dumont |
1 fine surgical scissor | Fine Science Tools | 14058-11 | Dumont |
100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
2 straight fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont |
60 mm Petri dish | Corning | 430196 | |
70% ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2801 | Ethanol 190 Proof |
Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
Bench pads | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Cell Culture | |||
Anti-Biotin MicroBeads 1mL | Miltenyi Biotec | 130-115-390 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-50G | |
Buffer Y | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Buffer Z | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Enzyme A | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Enzyme P | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
GG-12-1.5, 12 mm dia.#1.5 thick 100 pc cell culture tested German coverglasses | Neuvitro Corporation | GG-12-15 | |
Gibco B-27 Supplement 10 mL | ThermoFisher | 17504-044 | |
Gibco Basal Medium Eagle (BME) 500 mL | ThermoFisher | 21010046 | (+) Earle's Salts, (-) L-Glutamine |
Gibco HBBS (1x) Hanks' Balanced Salt Solution 500 mL | ThermoFisher | 14025092 | Calcium, Magnesium, No phenol red |
Gibco HI FBS 100 mL | ThermoFisher | 16140-063 | |
Gibco L-Glutamine 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030-081 | |
Gibco Penicilline/Streptomicine | ThermoFisher | 15140-122 | 10,000 U/mL |
Gibco Sodium Pyruvate (100 mM) 100 mL | ThermoFisher | 11360070 | |
MiniMACS Separator and Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 0.25 μg/106 cells |
MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Neaubeaur-Improved Brightline 100 µm Chamber | Hausser Scientific | 3120 | |
Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
Neuronal Culture Medium 500 mL | ThermoFisher | 88283 | |
Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail mouse 1 mL | Miltenyi Biotec | 130-115-389 | |
Olympus SZ61 Zoom Stereomicroscope | Olympus Life Science | SZ61/SZ51 | |
Pierce Primary Neuron Isolation Kit | ThermoFisher | 88280Y | |
Staining | |||
Anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | 1 : 800 |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32766 | 1 : 500 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher | A32790 | 1 : 500 |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma Aldrich | MFCD00131855 | |
Goat anti-Chicken IgY (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647 | ThemoFisher | A32933 | 1 : 500 |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A11037 | 1 : 200 |
Invitrogen Leptin Receptor Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (JA73-01) | ThermoFisher | MA5-32685 | 1 : 500 |
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D Systems | ABAF497 | 1 : 500 |
POMC Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D3R1U | 1 : 500 |
PSD95 (D74D3) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | D74D3#3409 | 1 : 500 |
Streptavidin, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher | S11227 | 1 : 500 |
Synapsin 1 Monoclonal Antibody (7H10G6) | ThermoFisher | MA5-31919 | 1 : 500 |
Vectashield Plus Antifade Mountina Medium with DAPI 10 mL | Vector Laboratories | H-2000 |