High-throughput optogenetik eksperimenter i gær ved hjælp af den automatiserede platform Lustro
Summary
Denne protokol skitserer trinene til brug af den automatiserede platform Lustro til at udføre karakterisering af høj gennemstrømning af optogenetiske systemer i gær.
Abstract
Optogenetik giver præcis kontrol over cellulær adfærd ved at udnytte genetisk kodede lysfølsomme proteiner. Optimering af disse systemer for at opnå den ønskede funktionalitet kræver dog ofte flere design-build-testcyklusser, hvilket kan være tidskrævende og arbejdskrævende. For at løse denne udfordring har vi udviklet Lustro, en platform, der kombinerer lysstimulering med laboratorieautomatisering, hvilket muliggør effektiv high-throughput screening og karakterisering af optogenetiske systemer.
Lustro bruger en automatiseringsarbejdsstation udstyret med en belysningsenhed, en rysteenhed og en pladelæser. Ved at anvende en robotarm automatiserer Lustro bevægelsen af en mikrobrøndplade mellem disse enheder, hvilket muliggør stimulering af optogenetiske stammer og måling af deres respons. Denne protokol giver en trin-for-trin guide til brug af Lustro til at karakterisere optogenetiske systemer til genekspressionskontrol i den spirende gær Saccharomyces cerevisiae. Protokollen dækker opsætningen af Lustros komponenter, herunder integrationen af belysningsenheden med automatiseringsarbejdsstationen. Det giver også detaljerede instruktioner til programmering af belysningsenheden, pladelæseren og robotten, hvilket sikrer jævn drift og dataindsamling gennem hele eksperimentprocessen.
Introduction
Optogenetik er en kraftfuld teknik, der bruger lysfølsomme proteiner til at kontrollere cellernes adfærd med høj præcision 1,2,3. Imidlertid kan prototyping af optogenetiske konstruktioner og identifikation af optimale belysningsforhold være tidskrævende, hvilket gør det vanskeligt at optimere optogenetiske systemer 4,5. High-throughput metoder til hurtigt at screene og karakterisere aktiviteten af optogenetiske systemer kan fremskynde design-build-testcyklussen for prototyping konstruktioner og udforske deres funktion.
Lustro-platformen blev udviklet som en laboratorieautomatiseringsteknik designet til screening og karakterisering af optogenetiske systemer med høj kapacitet. Den integrerer en mikropladelæser, belysningsenhed og rysteenhed med en automatiseringsarbejdsstation6. Lustro kombinerer automatiseret dyrkning og lysstimulering af celler i mikrobrøndplader (figur 1 og supplerende figur 1), hvilket muliggør hurtig screening og sammenligning af forskellige optogenetiske systemer. Lustro-platformen er meget tilpasningsdygtig og kan generaliseres til at arbejde med andre laboratorieautomatiseringsrobotter, belysningsenheder, pladelæsere, celletyper og optogenetiske systemer, herunder dem, der reagerer på forskellige bølgelængder af lys.
Denne protokol demonstrerer opsætningen og brugen af Lustro til karakterisering af et optogenetisk system. Optogenetisk kontrol af split transkriptionsfaktorer i gær bruges som et eksempelsystem til at illustrere platformens funktion og anvendelighed ved at undersøge forholdet mellem lysinput og ekspressionen af et fluorescerende reportergen, mScarlet-I7. Ved at følge denne protokol kan forskere strømline optimeringen af optogenetiske systemer og fremskynde opdagelsen af nye strategier for dynamisk kontrol af biologiske systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lustro-protokollen, der præsenteres her, automatiserer dyrknings-, belysnings- og måleprocesserne, hvilket muliggør screening og karakterisering af optogenetiske systemer med høj kapacitet6. Dette opnås ved at integrere en belysningsenhed, mikropladelæser og rysteenhed i en automatiseringsarbejdsstation. Denne protokol demonstrerer specifikt Lustros anvendelighed til screening af forskellige optogenetiske konstruktioner integreret i gæren S. cerevisiae og sammenligning af lysindukt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health grant R35GM128873 og National Science Foundation grant 2045493 (tildelt M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. har en karrierepris ved Scientific Interface fra Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. blev støttet af et NHGRI træningsstipendium til Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760. Vi anerkender frugtbare diskussioner med McClean-laboratoriemedlemmer, og især er vi taknemmelige for Kieran Sweeney for at give kommentarer til manuskriptet.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. . A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- . Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- . YPD media. 2010 (9), (2010).
- . . Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -. B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
