Optogenetikkeksperimenter med høy gjennomstrømning i gjær ved hjelp av den automatiserte plattformen Lustro
Summary
Denne protokollen skisserer trinnene for bruk av den automatiserte plattformen Lustro for å utføre høy gjennomstrømningskarakterisering av optogenetiske systemer i gjær.
Abstract
Optogenetikk gir presis kontroll over cellulær oppførsel ved å benytte genetisk kodede lysfølsomme proteiner. Optimalisering av disse systemene for å oppnå ønsket funksjonalitet krever imidlertid ofte flere design-build-test-sykluser, noe som kan være tidkrevende og arbeidskrevende. For å møte denne utfordringen har vi utviklet Lustro, en plattform som kombinerer lysstimulering med laboratorieautomatisering, noe som muliggjør effektiv screening og karakterisering av optogenetiske systemer med høy gjennomstrømning.
Lustro benytter en automatiseringsarbeidsstasjon utstyrt med en belysningsenhet, en risteanordning og en plateleser. Ved å bruke en robotarm automatiserer Lustro bevegelsen av en mikrobrønnplate mellom disse enhetene, noe som muliggjør stimulering av optogenetiske stammer og måling av deres respons. Denne protokollen gir en trinnvis veiledning om bruk av Lustro for å karakterisere optogenetiske systemer for genuttrykkskontroll i den spirende gjæren Saccharomyces cerevisiae. Protokollen dekker oppsettet av Lustros komponenter, inkludert integrering av belysningsenheten med automatiseringsarbeidsstasjonen. Den gir også detaljerte instruksjoner for programmering av belysningsenheten, plateleseren og roboten, noe som sikrer jevn drift og datainnsamling gjennom hele eksperimentprosessen.
Introduction
Optogenetikk er en kraftig teknikk som benytter lysfølsomme proteiner for å kontrollere oppførselen til celler med høy presisjon 1,2,3. Imidlertid kan prototyping av optogenetiske konstruksjoner og identifisering av optimale belysningsforhold være tidkrevende, noe som gjør det vanskelig å optimalisere optogenetiske systemer 4,5. Høykapasitetsmetoder for raskt å skjerme og karakterisere aktiviteten til optogenetiske systemer kan akselerere design-build-test-syklusen for prototyping av konstruksjoner og utforsking av deres funksjon.
Lustro-plattformen ble utviklet som en laboratorieautomatiseringsteknikk designet for høy gjennomstrømningsscreening og karakterisering av optogenetiske systemer. Den integrerer en mikroplateleser, belysningsenhet og risteenhet med en automatiseringsarbeidsstasjon6. Lustro kombinerer automatisert dyrking og lysstimulering av celler i mikrobrønnplater (figur 1 og tilleggsfigur 1), noe som muliggjør rask screening og sammenligning av forskjellige optogenetiske systemer. Lustro-plattformen er svært tilpasningsdyktig og kan generaliseres til å fungere med andre laboratorieautomatiseringsroboter, belysningsenheter, platelesere, celletyper og optogenetiske systemer, inkludert de som reagerer på forskjellige bølgelengder av lys.
Denne protokollen demonstrerer oppsettet og bruken av Lustro for å karakterisere et optogenetisk system. Optogenetisk kontroll av delte transkripsjonsfaktorer i gjær brukes som et eksempelsystem for å illustrere funksjonen og nytten av plattformen ved å undersøke forholdet mellom lysinnganger og uttrykket av et fluorescerende reportergen, mScarlet-I7. Ved å følge denne protokollen kan forskere strømlinjeforme optimaliseringen av optogenetiske systemer og akselerere oppdagelsen av nye strategier for dynamisk kontroll av biologiske systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lustro-protokollen som presenteres her automatiserer dyrkings-, belysnings- og måleprosessene, noe som muliggjør høy gjennomstrømningsscreening og karakterisering av optogenetiske systemer6. Dette oppnås ved å integrere en belysningsenhet, mikroplateleser og risteenhet i en automatiseringsarbeidsstasjon. Denne protokollen demonstrerer spesifikt Lustros nytte for screening av forskjellige optogenetiske konstruksjoner integrert i gjæren S. cerevisiae og sammenligning av lysinduksjons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant R35GM128873 og National Science Foundation grant 2045493 (tildelt MNM). Megan Nicole McClean, Ph.D. har en Career Award på Scientific Interface fra Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. ble støttet av et NHGRI treningsstipend til Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760. Vi anerkjenner fruktbare diskusjoner med McClean lab-medlemmer, og spesielt er vi takknemlige for Kieran Sweeney for å gi kommentarer til manuskriptet.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. . A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- . Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- . YPD media. 2010 (9), (2010).
- . . Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -. B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
