Высокопроизводительные оптогенетические эксперименты на дрожжах с использованием автоматизированной платформы Lustro
Summary
В этом протоколе описаны шаги по использованию автоматизированной платформы Lustro для выполнения высокопроизводительной характеристики оптогенетических систем в дрожжах.
Abstract
Оптогенетика обеспечивает точный контроль над поведением клеток, используя генетически закодированные светочувствительные белки. Однако оптимизация этих систем для достижения желаемой функциональности часто требует нескольких циклов проектирования-сборки-тестирования, что может быть трудоемким и трудоемким. Чтобы решить эту проблему, мы разработали Lustro, платформу, которая сочетает в себе световую стимуляцию с лабораторной автоматизацией, обеспечивая эффективный высокопроизводительный скрининг и определение характеристик оптогенетических систем.
Lustro использует автоматизированное рабочее место, оснащенное устройством освещения, встряхивающим устройством и считывателем номерных знаков. Используя роботизированную руку, Lustro автоматизирует перемещение микролунки между этими устройствами, позволяя стимулировать оптогенетические штаммы и измерять их реакцию. Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по использованию Lustro для характеристики оптогенетических систем для контроля экспрессии генов у почковавшихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Протокол охватывает настройку компонентов Lustro, включая интеграцию осветительного устройства с автоматизированным рабочим местом. Он также содержит подробные инструкции по программированию осветительного устройства, считывателя пластин и робота, обеспечивая бесперебойную работу и сбор данных на протяжении всего экспериментального процесса.
Introduction
Оптогенетика является мощным методом, который использует светочувствительные белки для управления поведением клеток с высокой точностью 1,2,3. Однако прототипирование оптогенетических конструкций и определение оптимальных условий освещения может занимать много времени, что затрудняет оптимизацию оптогенетических систем 4,5. Высокопроизводительные методы быстрого скрининга и определения характеристик активности оптогенетических систем могут ускорить цикл «проектирование-строительство-тестирование» для прототипирования конструкций и изучения их функций.
Платформа Lustro была разработана как метод автоматизации лаборатории, предназначенный для высокопроизводительного скрининга и характеризации оптогенетических систем. Он объединяет считыватель микропланшетов, устройство освещения и устройство встряхивания с автоматизированной рабочей станцией6. Lustro сочетает в себе автоматизированное культивирование и световую стимуляцию клеток в микролуночных планшетах (рис. 1 и дополнительный рис. 1), что позволяет проводить быстрый скрининг и сравнение различных оптогенетических систем. Платформа Lustro обладает широкими возможностями адаптации и может быть универсализирована для работы с другими роботами автоматизации лабораторий, устройствами освещения, считывателями пластин, типами клеток и оптогенетическими системами, в том числе реагирующими на различные длины волн света.
Этот протокол демонстрирует настройку и использование Lustro для характеристики оптогенетической системы. Оптогенетический контроль расщепленных транскрипционных факторов у дрожжей используется в качестве примера системы, чтобы проиллюстрировать функцию и полезность платформы путем исследования взаимосвязи между световыми входами и экспрессией флуоресцентного репортерного гена mScarlet-I7. Следуя этому протоколу, исследователи могут оптимизировать оптогенетические системы и ускорить открытие новых стратегий динамического управления биологическими системами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол Lustro, представленный здесь, автоматизирует процессы культивирования, освещения и измерения, обеспечивая высокопроизводительный скрининг и определение характеристик оптогенетических систем6. Это достигается за счет интеграции осветительного устройства, считыва…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения R35GM128873 и грантом Национального научного фонда 2045493 (присужден M.N.M.). Меган Николь Макклин, доктор философии, имеет награду за карьеру в Scientific Interface от Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. был поддержан грантом NHGRI на обучение в рамках учебной программы геномных наук 5T32HG002760. Мы признательны за плодотворные дискуссии с сотрудниками лаборатории McClean, и, в частности, благодарны Кирану Суини (Kieran Sweeney) за комментарии к рукописи.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. . A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- . Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- . YPD media. 2010 (9), (2010).
- . . Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -. B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
