Otomatik platform Lustro kullanılarak mayada yüksek verimli optogenetik deneyler
Summary
Bu protokol, mayadaki optogenetik sistemlerin yüksek verimli karakterizasyonunu gerçekleştirmek için otomatik platform Lustró’yu kullanma adımlarını özetlemektedir.
Abstract
Optogenetik, genetik olarak kodlanmış ışığa duyarlı proteinleri kullanarak hücresel davranış üzerinde hassas kontrol sağlar. Bununla birlikte, istenen işlevselliği elde etmek için bu sistemleri optimize etmek, genellikle zaman alıcı ve emek yoğun olabilen birden fazla tasarım-yapı-test döngüsü gerektirir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, ışık stimülasyonunu laboratuvar otomasyonu ile birleştiren, optogenetik sistemlerin verimli yüksek verimli taramasını ve karakterizasyonunu sağlayan bir platform olan Lustro’yu geliştirdik.
Lustró, bir aydınlatma cihazı, bir sallama cihazı ve bir plaka okuyucu ile donatılmış bir otomasyon iş istasyonu kullanır. Lustró, robotik bir kol kullanarak, bu cihazlar arasında bir mikrokuyu plakasının hareketini otomatikleştirerek optogenetik suşların uyarılmasına ve tepkilerinin ölçülmesine olanak tanır. Bu protokol, tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae’de gen ekspresyon kontrolü için optogenetik sistemleri karakterize etmek için Lustro kullanımı hakkında adım adım bir kılavuz sağlar. Protokol, aydınlatma cihazının otomasyon iş istasyonuyla entegrasyonu da dahil olmak üzere Lustro bileşenlerinin kurulumunu kapsar. Ayrıca aydınlatma cihazını, plaka okuyucuyu ve robotu programlamak için ayrıntılı talimatlar sağlayarak deney süreci boyunca sorunsuz çalışma ve veri toplama sağlar.
Introduction
Optogenetik, hücrelerin davranışını yüksek hassasiyetlekontrol etmek için ışığa duyarlı proteinleri kullanan güçlü bir tekniktir 1,2,3. Bununla birlikte, optogenetik yapıların prototiplenmesi ve optimum aydınlatma koşullarının belirlenmesi zaman alıcı olabilirve bu da optogenetik sistemleri optimize etmeyi zorlaştırır 4,5. Optogenetik sistemlerin aktivitesini hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için yüksek verimli yöntemler, yapıların prototiplenmesi ve işlevlerinin keşfedilmesi için tasarım-yapı-test döngüsünü hızlandırabilir.
Lustro platformu, optogenetik sistemlerin yüksek verimli taraması ve karakterizasyonu için tasarlanmış bir laboratuvar otomasyon tekniği olarak geliştirilmiştir. Bir mikroplaka okuyucu, aydınlatma cihazı ve çalkalama cihazını bir otomasyon iş istasyonu6 ile entegre eder. Lutro, mikrokuyu plakalarında (Şekil 1 ve Ek Şekil 1) hücrelerin otomatik kültürlenmesini ve ışık stimülasyonunu birleştirerek, farklı optogenetik sistemlerin hızlı bir şekilde taranmasını ve karşılaştırılmasını sağlar. Lustro platformu son derece uyarlanabilir ve farklı dalga boylarındaki ışığa yanıt verenler de dahil olmak üzere diğer laboratuvar otomasyon robotları, aydınlatma cihazları, plaka okuyucular, hücre tipleri ve optogenetik sistemlerle çalışmak üzere genelleştirilebilir.
Bu protokol, bir optogenetik sistemi karakterize etmek için Lustró’nun kurulumunu ve kullanımını gösterir. Mayadaki bölünmüş transkripsiyon faktörlerinin optogenetik kontrolü, ışık girdileri ile bir floresan raportör genin ekspresyonu olan mScarlet-I7 arasındaki ilişkiyi araştırarak platformun işlevini ve faydasını göstermek için örnek bir sistem olarak kullanılır. Araştırmacılar bu protokolü izleyerek optogenetik sistemlerin optimizasyonunu kolaylaştırabilir ve biyolojik sistemlerin dinamik kontrolü için yeni stratejilerin keşfini hızlandırabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan Lustro protokolü, kültürleme, aydınlatma ve ölçüm süreçlerini otomatikleştirerek optogenetik sistemlerin yüksek verimli taranmasını ve karakterizasyonunu sağlar6. Bu, bir aydınlatma cihazı, mikroplaka okuyucu ve çalkalama cihazının bir otomasyon iş istasyonuna entegre edilmesiyle elde edilir. Bu protokol, özellikle Lustro’nun maya S. cerevisiae’ye entegre edilmiş farklı optogenetik yapıları taramak ve ışık indüksiyon programlarını karşılaşt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe R35GM128873 ve Ulusal Bilim Vakfı hibe 2045493 (M.N.M.’ye verildi) tarafından desteklenmiştir. Megan Nicole McClean, Ph.D. Burroughs Wellcome Fund’dan Scientific Interface’de Kariyer Ödülü’ne sahiptir. Z.P.H., Genomik Bilimler Eğitim Programı 5T32HG002760’a NHGRI eğitim bursu ile desteklenmiştir. McClean laboratuvar üyeleriyle yapılan verimli tartışmaları kabul ediyoruz ve özellikle makale hakkında yorum yaptığı için Kieran Sweeney’e minnettarız.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. . A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- . Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- . YPD media. 2010 (9), (2010).
- . . Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -. B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
