Expériences d’optogénétique à haut débit dans la levure à l’aide de la plateforme automatisée Lustro
Summary
Ce protocole décrit les étapes de l’utilisation de la plate-forme automatisée Lustro pour effectuer une caractérisation à haut débit des systèmes optogénétiques chez la levure.
Abstract
L’optogénétique offre un contrôle précis du comportement cellulaire en utilisant des protéines sensibles à la lumière codées génétiquement. Cependant, l’optimisation de ces systèmes pour obtenir les fonctionnalités souhaitées nécessite souvent plusieurs cycles de conception, de construction et de test, ce qui peut prendre beaucoup de temps et de main-d’œuvre. Pour relever ce défi, nous avons développé Lustro, une plateforme qui combine la stimulation lumineuse avec l’automatisation du laboratoire, permettant un criblage et une caractérisation efficaces à haut débit des systèmes optogénétiques.
Lustro utilise un poste de travail d’automatisation équipé d’un dispositif d’éclairage, d’un dispositif d’agitation et d’un lecteur de plaques. En utilisant un bras robotisé, Lustro automatise le mouvement d’une plaque de micropuits entre ces dispositifs, ce qui permet de stimuler les souches optogénétiques et de mesurer leur réponse. Ce protocole fournit un guide étape par étape sur l’utilisation de Lustro pour caractériser les systèmes optogénétiques pour le contrôle de l’expression génique chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae. Le protocole couvre la configuration des composants de Lustro, y compris l’intégration du dispositif d’éclairage avec le poste de travail d’automatisation. Il fournit également des instructions détaillées pour la programmation du dispositif d’éclairage, du lecteur de plaques et du robot, garantissant un fonctionnement fluide et l’acquisition de données tout au long du processus expérimental.
Introduction
L’optogénétique est une technique puissante qui utilise des protéines sensibles à la lumière pour contrôler le comportement des cellules avec une grande précision 1,2,3. Cependant, le prototypage de constructions optogénétiques et l’identification des conditions d’éclairage optimales peuvent prendre beaucoup de temps, ce qui rend difficile l’optimisation des systèmes optogénétiques 4,5. Des méthodes à haut débit permettant de cribler et de caractériser rapidement l’activité des systèmes optogénétiques peuvent accélérer le cycle conception-construction-test pour le prototypage des constructions et l’exploration de leur fonction.
La plate-forme Lustro a été développée en tant que technique d’automatisation de laboratoire conçue pour le criblage et la caractérisation à haut débit des systèmes optogénétiques. Il intègre un lecteur de microplaques, un dispositif d’éclairage et un dispositif d’agitation avec un poste de travail d’automatisation6. Lustro combine la culture automatisée et la stimulation par la lumière des cellules dans des plaques de micropuits (Figure 1 et Figure supplémentaire 1), ce qui permet le criblage et la comparaison rapides de différents systèmes optogénétiques. La plate-forme Lustro est hautement adaptable et peut être généralisée pour fonctionner avec d’autres robots d’automatisation de laboratoire, des dispositifs d’éclairage, des lecteurs de plaques, des types de cellules et des systèmes optogénétiques, y compris ceux qui répondent à différentes longueurs d’onde de la lumière.
Ce protocole démontre la configuration et l’utilisation de Lustro pour caractériser un système optogénétique. Le contrôle optogénétique des facteurs de transcription fractionnés chez la levure est utilisé comme exemple de système pour illustrer la fonction et l’utilité de la plate-forme en sondant la relation entre les entrées lumineuses et l’expression d’un gène rapporteur fluorescent, mScarlet-I7. En suivant ce protocole, les chercheurs peuvent rationaliser l’optimisation des systèmes optogénétiques et accélérer la découverte de nouvelles stratégies pour le contrôle dynamique des systèmes biologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole Lustro présenté ici automatise les processus de culture, d’éclairage et de mesure, permettant un criblage et une caractérisation à haut débit des systèmes optogénétiques6. Ceci est réalisé en intégrant un dispositif d’éclairage, un lecteur de microplaques et un dispositif d’agitation dans un poste de travail d’automatisation. Ce protocole démontre spécifiquement l’utilité de Lustro pour le criblage de différentes constructions optogénétiques intégrées da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les R35GM128873 de subvention des National Institutes of Health et les 2045493 de subvention de la National Science Foundation (attribués à M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D., est titulaire d’une bourse de carrière à l’interface scientifique du Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. a bénéficié d’une subvention de formation du NHGRI pour le programme de formation en sciences génomiques 5T32HG002760. Nous reconnaissons les discussions fructueuses avec les membres du laboratoire McClean et, en particulier, nous sommes reconnaissants à Kieran Sweeney d’avoir fourni des commentaires sur le manuscrit.
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
References
- Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839 (2022).
- Lan, T. -. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends in Genetics. 38 (12), 1253-1270 (2022).
- Olson, E. J., Tabor, J. J. Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology. Nature Chemical Biology. 10, 502-511 (2014).
- Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo Activities of Light Inducible Dimers: a Cellular Optogenetics Guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
- Scott, T. D., Sweeney, K., McClean, M. N. Biological signal generators: integrating synthetic biology tools and in silico control. Current Opinion in Systems Biology. 14, 58-65 (2019).
- Harmer, Z. P., McClean, M. N. Lustro: High-throughput optogenetic experiments enabled by automation and a yeast optogenetic toolkit. ACS Synthetic Biology. 12 (7), 1943-1951 (2023).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
- Höhener, T. C., Landolt, A. E., Dessauges, C., Hinderling, L., Gagliardi, P. A., Pertz, O. LITOS: a versatile LED illumination tool for optogenetic stimulation. Scientific Reports. 12 (1), 13139 (2022).
- Grødem, E. O., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
- Dunlop, M. J. . A supplemental guide to building the optoPlate-96. , (2021).
- Thomas, O. S., Hörner, M., Weber, W. A graphical user interface to design high-throughput optogenetic experiments with the optoPlate-96. Nature Protocols. 15 (9), 2785-2787 (2020).
- Robertson, J. B., Davis, C. R., Johnson, C. H. Visible light alters yeast metabolic rhythms by inhibiting respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 21130-21135 (2013).
- . Synthetic Complete (SC) Medium. 2016 (11), (2016).
- Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
- Hecht, A., Endy, D., Salit, M., Munson, M. S. When wavelengths collide: bias in cell abundance measurements due to expressed fluorescent proteins. ACS Synthetic Biology. 5 (9), 1024-1027 (2016).
- . YPD media. 2010 (9), (2010).
- . . Low-Fluorescence Yeast Nitrogen Base without Riboflavin and Folic Acid Medium (LFM). 2016 (11), (2016).
- Csibra, E., Stan, G. -. B. Parsley: a web app for parsing data from plate readers. Zenodo. , (2023).
- Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6 (1), 35363 (2016).
- Gutiérrez Mena, J., Kumar, S., Khammash, M. Dynamic cybergenetic control of bacterial co-culture composition via optogenetic feedback. Nature Communications. 13, 4808 (2022).
- Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
- Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546 (2016).
- Bertaux, F., et al. Enhancing bioreactor arrays for automated measurements and reactive control with ReacSight. Nature Communications. 13 (1), 3363 (2022).
- Benisch, M., Benzinger, D., Kumar, S., Hu, H., Khammash, M. Optogenetic closed-loop feedback control of the unfolded protein response optimizes protein production. Metabolic Engineering. 77, 32-40 (2023).
- Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology. 6 (3), 366-372 (2014).
- Datta, S., et al. High-throughput feedback-enabled optogenetic stimulation and spectroscopy in microwell plates. bioRxiv. , (2022).
- Pouzet, S., et al. Optogenetic control of beta-carotene bioproduction in yeast across multiple lab-scales. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 11, 1085268 (2023).
- Pouzet, S., Banderas, A., Le Bec, M., Lautier, T., Truan, G., Hersen, P. The promise of optogenetics for bioproduction: dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
