स्वचालित प्लेटफ़ॉर्म लस्ट्रो का उपयोग करके खमीर में उच्च-थ्रूपुट ऑप्टोजेनेटिक्स प्रयोग
Summary
यह प्रोटोकॉल खमीर में ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के उच्च-थ्रूपुट लक्षण वर्णन करने के लिए स्वचालित प्लेटफ़ॉर्म लस्ट्रो का उपयोग करने के लिए चरणों को रेखांकित करता है।
Abstract
ऑप्टोजेनेटिक्स आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड प्रकाश-संवेदनशील प्रोटीन का उपयोग करके सेलुलर व्यवहार पर सटीक नियंत्रण प्रदान करता है। हालांकि, वांछित कार्यक्षमता प्राप्त करने के लिए इन प्रणालियों को अनुकूलित करने के लिए अक्सर कई डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट चक्रों की आवश्यकता होती है, जो समय लेने वाली और श्रम-गहन हो सकती हैं। इस चुनौती का समाधान करने के लिए, हमने लस्ट्रो विकसित किया है, एक मंच जो प्रयोगशाला स्वचालन के साथ प्रकाश उत्तेजना को जोड़ता है, जिससे ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के कुशल उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन को सक्षम किया जा सकता है।
लस्ट्रो एक रोशनी उपकरण, एक हिलाने वाले उपकरण और एक प्लेट रीडर से लैस एक स्वचालन वर्कस्टेशन का उपयोग करता है। एक रोबोट हाथ को नियोजित करके, लस्ट्रो इन उपकरणों के बीच एक माइक्रोवेल प्लेट की गति को स्वचालित करता है, जिससे ऑप्टोजेनेटिक उपभेदों की उत्तेजना और उनकी प्रतिक्रिया के माप की अनुमति मिलती है। यह प्रोटोकॉल नवोदित खमीर सैकरोमाइसेस सेरेविसिया में जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण के लिए ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम को चिह्नित करने के लिए लस्ट्रो का उपयोग करने पर एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करता है। प्रोटोकॉल में स्वचालन वर्कस्टेशन के साथ रोशनी डिवाइस के एकीकरण सहित लस्ट्रो के घटकों का सेटअप शामिल है। यह रोशनी डिवाइस, प्लेट रीडर और रोबोट की प्रोग्रामिंग के लिए विस्तृत निर्देश भी प्रदान करता है, जो प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान सुचारू संचालन और डेटा अधिग्रहण सुनिश्चित करता है।
Introduction
ऑप्टोजेनेटिक्स एक शक्तिशाली तकनीक है जो उच्च परिशुद्धता 1,2,3 के साथ कोशिकाओं के व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए प्रकाश-संवेदनशील प्रोटीन का उपयोग करती है। हालांकि, प्रोटोटाइप ऑप्टोजेनेटिक संरचनाओं और इष्टतम रोशनी की स्थिति की पहचान करना समय लेने वाला हो सकता है, जिससे ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम 4,5 को अनुकूलित करना मुश्किल हो जाता है। ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम की गतिविधि को तेजी से स्क्रीन और चिह्नित करने के लिए उच्च-थ्रूपुट विधियां प्रोटोटाइप संरचनाओं के लिए डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट चक्र में तेजी ला सकती हैं और उनके कार्य की खोज कर सकती हैं।
लस्ट्रो प्लेटफॉर्म को एक प्रयोगशाला स्वचालन तकनीक के रूप में विकसित किया गया था जिसे ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन के लिए डिज़ाइन किया गया था। यह एक स्वचालन वर्कस्टेशन6 के साथ एक माइक्रोप्लेट रीडर, रोशनी डिवाइस और हिलाने वाले डिवाइस को एकीकृत करता है। लस्ट्रो माइक्रोवेल प्लेटों (चित्रा 1 और पूरक चित्रा 1) में कोशिकाओं के स्वचालित संवर्धन और प्रकाश उत्तेजना को जोड़ती है, जिससे विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम की तेजी से स्क्रीनिंग और तुलना संभव होती है। लस्ट्रो प्लेटफॉर्म अत्यधिक अनुकूलनीय है और इसे अन्य प्रयोगशाला स्वचालन रोबोट, रोशनी उपकरणों, प्लेट रीडर, सेल प्रकार और ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के साथ काम करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है, जिसमें प्रकाश के विभिन्न तरंग दैर्ध्य के लिए उत्तरदायी शामिल हैं।
यह प्रोटोकॉल एक ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम को चिह्नित करने के लिए लस्ट्रो के सेटअप और उपयोग को दर्शाता है। खमीर में विभाजित प्रतिलेखन कारकों के ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण का उपयोग प्रकाश इनपुट और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन, एमस्कारलेट-आई7 की अभिव्यक्ति के बीच संबंधों की जांच करके मंच के कार्य और उपयोगिता को चित्रित करने के लिए एक उदाहरण प्रणाली के रूप में किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का पालन करके, शोधकर्ता ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के अनुकूलन को सुव्यवस्थित कर सकते हैं और जैविक प्रणालियों के गतिशील नियंत्रण के लिए नई रणनीतियों की खोज में तेजी ला सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत लस्ट्रो प्रोटोकॉल संवर्धन, रोशनी और माप प्रक्रियाओं को स्वचालित करता है, जिससे ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम6 के उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग और लक्षण वर्णन को सक्षम किया जा सकता है। यह एक रो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान R35GM128873 संस्थान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 2045493 (एमएनएम को सम्मानित) द्वारा समर्थित किया गया था। मेगन निकोल मैकक्लीन, पीएचडी बरोज़ वेलकम फंड से वैज्ञानिक इंटरफ़ेस में एक कैरियर पुरस्कार रखती है। जेडपीएच को जीनोमिक साइंसेज ट्रेनिंग प्रोग्राम 5टी32एचजी002760 के लिए एनएचजीआरआई प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम मैकक्लीन लैब के सदस्यों के साथ उपयोगी चर्चा को स्वीकार करते हैं, और विशेष रूप से, हम पांडुलिपि पर टिप्पणी प्रदान करने के लिए कीरन स्वीनी के आभारी हैं।
Materials
| 96-well glass bottom plate with #1.5 cover glass | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| BioShake 3000-T elm (heater shaker) | QINSTRUMENTS | ||
| Fluent Automation Workstation | Tecan | ||
| LITOS (alternative illumination device) | Hohener, et al. Scientific Reports. 2022 | ||
| optoPlate-96 (illumination device) | Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019 | ||
| Robotic Gripper Arm | Tecan | Standard or long Z axes; regular gripper head or automatic Finger Exchange System gripper head, both with a choice of gripper fingers – eccentric, long eccentric, centric, tube; barcode reader option | |
| Spark (plate reader) | Tecan | ||
| Synthetic Complete media | SigmaAldrich | Y1250 | |
| Tecan Connect (user alert app) | Tecan | ||
| yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ0::5' Ura3 homology, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homology his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5) | Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023 | ||
| YPD Agar | SigmaAldrich | Y1500 |
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