ここでは、マウスから初代蝸牛有毛細胞を単離して培養するための詳細なプロトコルを紹介します。最初に、コルチの器官は、顕微鏡下で新生児(3〜5日齢)のマウス蝸牛から解剖されました。その後、細胞を酵素的に消化して単一細胞懸濁液とし、数日間培養した後に免疫蛍光法を用いて同定しました。
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この記事について
サマリー
要約
蝸牛有毛細胞は、聴覚系の感覚受容器です。これらの細胞は、内耳の骨迷路内の聴覚を司る感覚器官であるコルチの器官にあります。蝸牛有毛細胞は、解剖学的にも機能的にも異なる2つのタイプ、すなわち外有毛細胞と内有毛細胞で構成されています。どちらかが損傷すると、難聴になります。特に、内有毛細胞は再生できず、損傷は永久的です。したがって、初代有毛細胞の in vitro 培養は、蝸牛有毛細胞の保護効果または再生効果を調べるために不可欠です。本研究は、マウス有毛細胞の単離・培養方法の発見を目的としています。
蝸牛側壁を手作業で除去した後、顕微鏡下で蝸牛モディオルスから聴覚上皮を細心の注意を払って解剖し、0.25%トリプシン-EDTAからなる混合物中で37°Cで10分間インキュベートし、200μLのピペットチップを使用して培地に静かに懸濁した。細胞懸濁液を細胞フィルターに通し、濾液を遠心分離し、細胞を24ウェルプレートで培養した。有毛細胞は、運動緊張に関与するメカノトランスダクション複合体であるミオシン-VIIaを発現する能力と、ファロイジンを用いたF-アクチンの選択的標識に基づいて同定されました。細胞は、培養で4d後に>90%のコンフルエントに達しました。この方法は、in vitro培養有毛細胞の生物学的特性の理解を深め、蝸牛有毛細胞培養の効率を実証し、さらなる聴覚研究のための確固たる方法論的基盤を確立することができます。
概要
蝸牛有毛細胞は、音の検出と聴覚神経への信号伝達に重要な役割を果たします。有毛細胞は、脊椎動物の一次感覚受容器として機能し、音の振動を電気信号に変換する機構的な細胞です。哺乳類の内耳の感覚上皮は、1列の内有毛細胞と3列の外有毛細胞で構成されています。有毛細胞は、さまざまな基本膜領域で、異なる周波数(20〜2,000Hz)の音を知覚します1。外有毛細胞の機能は、哺乳類の内耳を微調整するのに役立つ活発な機械的増幅プロセスであり、音に対する高い感度を与えます。内有毛細胞は音を検出する役割を担っています。段階的な脱分極の後、音響情報は聴覚神経線維2を介して脳に伝達される。
難聴は、遺伝的欠陥、加齢、騒音トラウマ、または耳毒性薬の過剰使用によって引き起こされる可能性があり、これらは世界中で主要な健康上の懸念を構成しています3,4。難聴は、主に有毛細胞への不可逆的な損傷に起因します5.騒音性難聴に関しては、研究者はその病因のいくつかの詳細についてコンセンサスに達していますが、多くの根本的なメカニズムの包括的な理解が欠けています。外側の有毛細胞は、音響の過露出に対して特に脆弱です6。機械....
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プロトコル
すべての動物実験は、西安交通大学動物の使用と管理に関する委員会によって承認されました(No.2021-847)。
1.滅菌と材料の準備
- 解剖器具を高温高圧蒸気消毒で滅菌し、50°Cのインキュベーターで一晩乾燥させます。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン/ストレプトマイシン10 mg/mLを含む培地100 mLを事前に調製し(10 mLのFBSと10 μLのペニシリン原液をダルベッコ修正イーグル培地(EMEM)90 mLに加える)し、4°Cで保存します。
2.聴覚上皮採取のための側頭骨の解剖と除去
- 合計10匹の新生児マウス(P3からP5)を氷上で首を切って安楽死させる。必要に応じて、倫理的に承認された別の方法論を使用します。
- 図1Aに示すように、頭を所定の位置に保持し、マイクロ操作ハサミを使用して矢状縫合糸に沿って頭皮を開き、指で頭皮を両側に分離して固定します。
- 小さな骨膜エレベーターを使用して脳を取り除き、基底頭蓋骨を二等分します。はさみで頭蓋骨を切り、前方にひっくり返して頭蓋骨を開きます。ハサミの先で脳を削り、頭蓋骨の付け根を露出させます。
- 頭蓋骨の基部に....
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結果
このプロトコルに続いて、単離された細胞に播種しました。初代蝸牛有毛細胞の種子は、細胞が培地中に浮遊せず、24時間以内に拡散した場合に成功したと見なされました。有毛細胞が付着し、皿の底で平らな凝集体に広がった後の有毛細胞の数を決定しました。1日後、生きた有毛細胞を培養皿の底にしっかりと接着させ、PBSでリンスすることにより非接着細胞を除去した。通常、細胞数は3d培養後に2倍になります(図2)。
免疫蛍光法(IF)により、ミオシン-VIIaおよびファロイジンの発現がd6まで明らかになりました(図3A)。その結果、ミオシン-VIIaのグレー値と陽性細胞比は時間とともに減少するのに対し、ファロイジンのグレー値と陽性細胞比は培養後のd1のものと比較して変わらないことが観察されました(図3B-D)。有機培養をポジティブコントロールとして使用し、ミオシ.......
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ディスカッション
HEI-OC1細胞株と比較して、有毛細胞の初代培養は、in vivoでの細胞の生理学的状態をより正確に再現しました。したがって、蝸牛器官から生細胞を単離し、直ちに培養する聴覚初代培養法は、聴覚系を広く研究する上で貴重なツールとなると考えられます。成功する文化には、特定のテクニックが不可欠です。第一に、側頭骨からコルチの器官が分離する期間を最小限に抑えることで、有毛細胞の活動が持続する可能性が高まります。したがって、研究者は臓器の解剖とPBSへの浸漬の間の時間間隔を最小限に抑えることが不可欠です。私たちの実験的観察に基づくと、約2〜3時間の持続時間は、10匹のマウスを解剖し、一度に20個の内耳を得るのに十分です。酵素解離プロセス中は、持続時間を12分に制限し、8分のインキュベーション期間後に蝸牛器官をピペットに移すことをお勧めします。約10回のピペッティングサイクル後に臓器を顕微鏡で観察し、ほぼすべての細胞が基底膜から剥離した時点で酵素的解離を停止しました。そうでなければ、臓器はさらに4分間インキュベーターに戻された。抗生物質の選択も重要です。一部のアミノグリコシド系抗生物質は耳毒性があり、有毛細胞死につながる可能性があるため、潜在的な汚.......
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開示事項
著者には開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学基金会(NFSC 82101224 to YG)の支援を受けました
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 100 mm BioLite細胞培養ディッシュ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 130182 | に使用 |
| 35 mm Nunc細胞培養ディッシュ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 150318 | に使用 |
| 6ウェル口蓋 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 310109005 | 使用 |
| 70 µフィルターに使用したm細胞ス | トレーナーBD会社 | 352350 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | 蛍光染色 |
| 抗ウサギIgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | 蛍光染色 |
| 3-5日目新生児マウス | 提供:西安交通大学 | ||
| ダルベッコs モディファイドイーグル ミディアム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11965092 | 培養 |
| 胎児ウシ血清 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 培養に使用する12483020 | |
| 鉗子 | デュモン | 5# | 解剖に使用する |
| ライカ解剖顕微鏡 | ドイツ | S9i | 剖に使用する |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 15140-122 | |
| 培養用ウサギ プライクローナル Myosin VIIa | Abcam 社 | ab92996 | 免疫蛍光 |
| ザー | Belevor | 10cm/04.0524.10 | 解剖用 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | トリ |
| プシン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25200072 | の培養用 |
参考文献
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581(2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E.
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再版と許可
