基于定量聚合酶链反应（qPCR）的幽 门螺杆菌 感染和抗生素耐药快速诊断

Summary

该协议提出了一种通过串测试快速诊断 幽门螺杆菌 胃感染的非侵入性方法，并使用定量聚合酶链反应（qPCR）确定其对克拉霉素和左氧氟沙星的抗生素耐药性。

Abstract

幽门螺杆菌是一种主要的人类病原体，感染了全球约一半的人口，并且由于其抗生素耐药性的增加而正在成为严重的健康威胁。它是慢性活动性胃炎、消化性溃疡病和胃癌的病原体，已被国际癌症研究机构列为 I 组致癌物。因此，快速准确地诊断幽门螺杆菌并测定其抗生素耐药性对于有效根除该细菌病原体具有重要意义。目前，幽门螺杆菌的诊断方法主要包括尿素呼气试验（UBT）、抗原试验、血清抗体试验、胃镜检查、快速尿素酶试验（RUT）和细菌培养。其中，前三种检测方法是非侵入性的，这意味着它们很容易进行测试。然而，细菌不能通过这些技术回收;因此，不能进行耐药性测试。最后三种是侵入性检查，但它们成本高昂，需要高技能，并且有可能对患者造成损害。因此，一种无创、快速、同步的幽门螺杆菌检测和耐药性检测方法对于临床上有效根除幽门螺杆菌非常重要。该协议旨在提出一种涉及串测试与定量聚合酶链反应（qPCR）相结合的特定程序，以快速检测幽门螺杆菌感染和抗生素耐药性。与细菌培养不同，该方法可以轻松、快速、无创地诊断幽门螺杆菌感染状态和耐药性。具体来说，我们使用qPCR检测幽门螺杆菌感染的rea以及分别编码对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性的23S rRNA和gyrA基因突变。与常规使用的培养技术相比，该方案提供了一种无创、低成本和省时的技术来检测幽门螺杆菌感染并使用 qPCR 确定其抗生素耐药性。

Introduction

幽门螺杆菌 是一种螺旋形、高度运动的革兰氏阴性细菌，主要生活在胃的幽门区域¹。它是一种常见的病原体，感染全球近 50% 的人口²。大多数 幽门螺杆菌 感染者没有临床表现，大多数在感染几年后会发展出不同的疾病，包括慢性胃炎、消化性溃疡、胃溃疡和胃癌³。在几项基于不同人群的研究中，已经证明了消除 幽门螺杆菌 预防胃癌和癌前病变的有效性^4，5。因此，世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构建议将根除 幽门螺杆菌 作为预防措施⁶。

使用无创方法识别 幽门螺杆菌 感染是大多数无症状消化不良患者治疗的关键组成部分。尿素呼气试验 （UBT）、 幽门螺杆菌 粪便抗原试验 （SAT） 和血清学检测是流行的无创技术。其中，UBT是侵入性最小且最准确的程序。UBT使用幽 门螺杆菌中大量存在的脲酶将同位素标记的尿素水解成氨和二氧化碳（13C或14C）。相比之下，免疫层析（ICA）⁷ 方便、简单且无创取样。但是，测试的准确性受多种因素的影响，例如粪便样本的质量、温度以及样本采集和测试之间的间隔。另一种基于免疫反应的测试是血清 幽门螺杆菌 抗体测试，该测试可检测患者血清中的抗体。然而，该测试不适合治疗后分析，因为抗体在细菌被清除后很长时间仍然存在⁸。另一个主要缺点是这些方法仅诊断 幽门螺杆菌 感染，不允许进行耐药性测试来指导基于敏感性的治疗。

对于侵入性检查方法，需要通过内镜检查取胃活检组织，然后进行组织学，脲酶快速测试和细菌培养。由于多种因素，这些测试方法也非常有限。目前，这些技术仅限于老年患者、癌前或恶性疾病高风险患者以及胃食管反流病或幽门螺杆菌^感染一线治疗失败的患者9。其次，由于幽门螺杆菌独特的生长特性，细菌培养的成功率仅达到50%¹⁰。因此，分子检测方法为克服侵入性检测方法的高要求和指导基于敏感性的治疗提供了新的希望。在分子检测方法中，定量PCR近年来取得了巨大的发展。与传统PCR不同，qPCR不需要凝胶电泳，通过在退火阶段添加引物和探针来准确定量样品中的DNA/RNA。用于检测幽门螺杆菌感染和耐药性的qPCR试剂盒现已上市。然而，每种方法都有其局限性;因此，应结合患者的症状、体征、病史、其他实验室检查和对治疗的反应来考虑患者的临床诊断和治疗。

目前，治疗 幽门螺杆菌 感染的主要方法是服用抗生素，但最近，由于抗生素耐药性的增加，治疗这些感染变得越来越困难。随后，全球观察到 幽门螺杆 菌治疗效果显着下降，使 幽门螺杆 菌根除成为一个主要的公共卫生问题¹¹。

克拉霉素和左氧氟沙星是用于治疗幽门螺杆菌引起的感染的两种广谱抗生素，但一些研究报告了幽门螺杆菌分离株对这两种药物的广泛耐药性。A2143G、A2142G 和 A2142C 是在 2.9 kb 23S rRNA 基因中发现的众多点突变中的三种，它们通过阻止大环内酯类药物结合而导致克拉霉素耐药。同时，左氧氟沙星耐药基因的突变位点主要位于gyrA基因¹²的6个突变位点（A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G）。这些基于基因突变的耐药机制的发现导致幽门螺杆菌的检测逐渐转变为基于培养的研究到分子检测。

总体而言，临床迫切需要一种无创、有效且同步的诊断方法来检测 幽门螺杆菌 感染和耐药性。采用串试验与qPCR相结合的方法，克服采样困难，达到不同引物探针同时检测 幽门螺杆菌 感染和耐药性的目的。

Protocol

本研究是根据中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理委员会建立的伦理考虑进行的（批准文号：KY-Q-2022-384-02）。本研究纳入了18-60岁年龄段的患者。检测前2周内服用抗生素、抗菌中药、质子泵抑制剂（PPI）或H2 受体拮抗剂等药物的患者未纳入本研究。那些在过去3个月内接受过 幽门螺杆菌 治疗的患者也被排除在这项研究之外。那些有严重心脏，肝脏，肾脏问题，严重神经病变?…

Representative Results

qPCR检测胃液中 幽门螺杆菌 感染和抗生素耐药性我们通过扩增尿素A基因进行qPCR检测幽门螺杆菌感染，并通过靶向23S rRNA基因和gyrA基因的点突变来确定其抗生素耐药性谱（表1）。所有三组qPCR实验的质控CT值均在推荐范围内，表明样品在实验时均处于正常状态，检测结果可靠。本研究选取了5个不同测试结果（S1-S5）的样品来表征实验方案的可?…

Discussion

幽门螺杆菌 检测可以使用侵入性和非侵入性方法进行¹³。常用的侵入性技术，如组织病理学、快速尿素酶检测、聚合酶链反应 （PCR） 和细菌培养，需要内镜检查和活检。血清学检测、尿素呼气试验和酶联免疫吸附试验 （ELISA） 被推荐用于非侵入性操作¹⁴。虽然非侵入性方法易于操作、经济且对患者更舒适，但幽 门螺杆 菌的分离和培养以进行额外…

Materials

23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent