Diagnosi rapida basata sulla reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) dell'infezione da Helicobacter pylori e della resistenza agli antibiotici
Summary
Il protocollo presenta un metodo non invasivo per la diagnosi rapida delle infezioni dello stomaco da Helicobacter pylori attraverso il test di stringa e determina la sua resistenza antibiotica alla claritromicina e alla levofloxacina utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR).
Abstract
L’Helicobacter pylori è un importante agente patogeno umano che infetta circa la metà della popolazione mondiale e sta diventando una seria minaccia per la salute a causa della sua crescente resistenza agli antibiotici. È l’agente eziologico della gastrite cronica attiva, dell’ulcera peptica e del cancro gastrico ed è stato classificato come cancerogeno di gruppo I dall’Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro. Pertanto, la diagnosi rapida e accurata di H. pylori e la determinazione della sua resistenza agli antibiotici sono importanti per l’eradicazione efficiente di questo patogeno batterico. Attualmente, i metodi di diagnosi di H. pylori includono principalmente il test del respiro dell’urea (UBT), il test dell’antigene, il test degli anticorpi del siero, la gastroscopia, il test rapido dell’ureasi (RUT) e la coltura batterica. Tra questi, i primi tre metodi di rilevamento non sono invasivi, il che significa che sono test facili da condurre. Tuttavia, i batteri non possono essere recuperati attraverso queste tecniche; Pertanto, i test di resistenza ai farmaci non possono essere eseguiti. Gli ultimi tre sono esami invasivi, ma sono costosi, richiedono competenze elevate e hanno il potenziale di causare danni ai pazienti. Pertanto, un metodo non invasivo, rapido e simultaneo per il rilevamento di H. pylori e test di resistenza ai farmaci è molto importante per sradicare efficacemente H. pylori nella pratica clinica . Questo protocollo mira a presentare una procedura specifica che prevede il test di stringa in combinazione con la reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) per la rapida rilevazione dell’infezione da H. pylori e della resistenza agli antibiotici. A differenza delle colture batteriche, questo metodo consente una diagnosi facile, rapida e non invasiva dello stato di infezione da H. pylori e della resistenza ai farmaci. In particolare, abbiamo utilizzato qPCR per rilevare rea per l’infezione da H. pylori e mutazioni nei geni 23S rRNA e gyrA , che codificano la resistenza contro la claritromicina e la levofloxacina, rispettivamente. Rispetto alle tecniche di coltura utilizzate di routine, questo protocollo fornisce una tecnica non invasiva, a basso costo e che consente di risparmiare tempo per rilevare l’infezione da H. pylori e determinare la sua resistenza agli antibiotici utilizzando qPCR.
Introduction
H. pylori è un batterio gram-negativo a forma di spirale, altamente mobile, che vive principalmente nella regione del piloro dello stomaco1. È un agente patogeno comune che infetta quasi il 50% della popolazione mondiale2. La maggior parte delle persone con infezione da H. pylori non ha manifestazioni cliniche e la maggior parte sviluppa diverse malattie dopo diversi anni di infezione, tra cui gastrite cronica, ulcere peptiche, ulcere gastriche e cancro gastrico3. In diversi studi basati su diverse popolazioni, l’efficacia dell’eliminazione di H. pylori per prevenire il cancro allo stomaco e le lesioni precancerose è stata dimostrata 4,5. Pertanto, l’Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro dell’Organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha consigliato l’eradicazione di H. pylori come misura preventiva6.
L’uso di metodi non invasivi per identificare l’infezione da H. pylori è una componente chiave del trattamento per la maggior parte delle persone con dispepsia asintomatica. Il test del respiro dell’urea (UBT), il test dell’antigene fecale H. pylori (SAT) e il test sierologico sono tecniche non invasive popolari. Tra queste, l’UBT è la procedura meno intrusiva e più accurata disponibile. UBT utilizza l’ureasi, abbondantemente presente in H. pylori, per idrolizzare l’urea marcata isotopicamente in ammoniaca e anidride carbonica (13C o 14C). Al contrario, il saggio immunocromatografico (ICA)7 è conveniente, semplice e non invasivo per il campionamento. Tuttavia, l’accuratezza del test è influenzata da diversi fattori, come la qualità del campione di feci, la temperatura e l’intervallo tra la raccolta del campione e il test. Un altro test basato sulla risposta immunitaria è il test degli anticorpi sierici H. pylori , che rileva gli anticorpi nel siero di un paziente. Tuttavia, questo test non è adatto per l’analisi post-trattamento poiché gli anticorpi rimangono a lungo dopo che i batteri sono stati eliminati8. Un altro grande svantaggio è che questi metodi diagnosticano solo l’infezione da H. pylori e non consentono test di resistenza ai farmaci per guidare il trattamento basato sulla sensibilità.
Per i metodi di test invasivi, il tessuto bioptico gastrico deve essere prelevato mediante endoscopia e quindi sottoposto a istologia, test rapido dell’ureasi e coltura batterica. Questi metodi di test sono anche molto limitati a causa di diversi fattori. Attualmente, queste tecniche sono limitate ai pazienti anziani, ai pazienti ad alto rischio di malattia precancerosa o maligna e ai pazienti che hanno fallito la terapia di prima linea per la malattia da reflusso gastroesofageo o l’infezione da H. pylori 9. In secondo luogo, a causa delle caratteristiche di crescita uniche di H. pylori, il tasso di successo della coltura batterica raggiunge solo il 50%10. Pertanto, i metodi di rilevamento molecolare offrono nuove speranze per superare le elevate esigenze dei metodi di rilevamento invasivi e guidare il trattamento basato sulla sensibilità. Tra i metodi di rilevamento molecolare, la PCR quantitativa si è evoluta enormemente negli ultimi anni. La qPCR, a differenza della PCR tradizionale, non richiede elettroforesi su gel e quantifica accuratamente il DNA/RNA nei campioni aggiungendo primer e sonde nella fase di ricottura. I kit qPCR per il rilevamento dell’infezione da H. pylori e della resistenza ai farmaci sono ora disponibili in commercio. Tuttavia, ogni metodo ha i suoi limiti; Pertanto, la diagnosi clinica e il trattamento di un paziente devono essere considerati in combinazione con i sintomi, i segni, la storia, altri test di laboratorio e la risposta al trattamento.
Attualmente, il metodo principale di trattamento delle infezioni da H.pylori sta assumendo antibiotici, ma ultimamente sta diventando sempre più difficile trattare queste infezioni a causa dell’aumento della resistenza agli antibiotici. Successivamente, un calo significativo dell’efficacia del trattamento con H. pylori è stato osservato a livello globale, rendendo l’eradicazione di H. pylori un importante problema di salute pubblica11.
Claritromicina e levofloxacina sono i due antibiotici ad ampio spettro usati per trattare le infezioni causate da H.pylori, ma diversi studi hanno riportato una diffusa resistenza contro questi due farmaci negli isolati di H.pylori. A2143G, A2142G e A2142C sono tre delle numerose mutazioni puntiformi trovate nel gene rRNA 2.9 kb 23S che provocano la resistenza alla claritromicina impedendo al macrolide di legarsi. Allo stesso tempo, i loci di mutazione del gene di resistenza alla levofloxacina sono localizzati principalmente nei sei siti di mutazione (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) del gene gyrA 12. La scoperta di questi meccanismi di resistenza basati su mutazioni genetiche ha portato a un graduale spostamento nella rilevazione di H. pylori attraverso studi basati sulla cultura ai test molecolari.
Nel complesso, vi è un’urgente necessità clinica di un metodo diagnostico non invasivo, efficace e simultaneo per il rilevamento delle infezioni da H. pylori e della resistenza ai farmaci. Abbiamo adottato un test combinato di stringa e un metodo qPCR per superare le difficoltà di campionamento e raggiungere l’obiettivo della rilevazione simultanea dell’infezione da H. pylori e della resistenza ai farmaci utilizzando diverse sonde primer.
Protocol
Representative Results
Discussion
La rilevazione di H. pylori può essere eseguita utilizzando metodi sia invasivi che non invasivi13. Le tecniche invasive comunemente usate come l’istopatologia, il test rapido dell’ureasi, la reazione a catena della polimerasi (PCR) e la coltura batterica richiedono endoscopia e biopsia. I test sierologici, i test del respiro dell’urea e i saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) sono raccomandati tra le procedure non invasive14. Mentre i metodi non invasivi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Sanming Project of Medicine di Shenzhen (Grant No. SZSM201510050) e la Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (sovvenzione n. 2022A1515220023). Fondazione di ricerca per talenti avanzati dell’ospedale popolare provinciale di Guandong (No. KJ012021097), e la National Natural Science Foundation of China (81871734, 82072380, 82272423). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
- Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12 (2022).
- Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
- Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
- Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
- IARC Helicobacter pylori Working Group. . Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , (2014).
- Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
- Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection – The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
- Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
- Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393 (2021).
- Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
- Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
- Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
- DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
- Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
- Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).
