Kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR)-baserad snabb diagnos av Helicobacter pylori-infektion och antibiotikaresistens
Summary
Protokollet presenterar en icke-invasiv metod för snabb diagnos av Helicobacter pylori maginfektioner genom strängtestet och bestämmer dess antibiotikaresistens mot klaritromycin och levofloxacin med kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR).
Abstract
Helicobacter pylori är en viktig mänsklig patogen som infekterar ungefär hälften av den globala befolkningen och blir ett allvarligt hälsohot på grund av dess ökande antibiotikaresistens. Det är orsakssambandet till kronisk aktiv gastrit, magsårssjukdom och magcancer och har klassificerats som en cancerframkallande grupp I av International Agency for Research on Cancer. Därför är den snabba och noggranna diagnosen av H. pylori och bestämningen av dess antibiotikaresistens viktiga för effektiv utrotning av denna bakteriella patogen. För närvarande inkluderar H. pylori-diagnosmetoder huvudsakligen urea-andningstestet (UBT), antigentestet, serumantikroppstestet, gastroskopi, det snabba ureastestet (RUT) och bakteriekultur. Bland dem är de tre första detektionsmetoderna icke-invasiva, vilket innebär att de är enkla tester att utföra. Bakterier kan dock inte hämtas genom dessa tekniker; Således kan läkemedelsresistenstestning inte utföras. De tre sista är invasiva undersökningar, men de är kostsamma, kräver hög kompetens och har potential att skada patienter. Därför är en icke-invasiv, snabb och samtidig metod för H. pylori-detektion och läkemedelsresistenstestning mycket viktig för att effektivt utrota H. pylori i klinisk praxis. Detta protokoll syftar till att presentera en specifik procedur som involverar strängtestet i kombination med kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR) för snabb detektion av H. pylori-infektion och antibiotikaresistens. Till skillnad från bakteriekulturer möjliggör denna metod enkel, snabb, icke-invasiv diagnos av H. pylori-infektionsstatus och läkemedelsresistens. Specifikt använde vi qPCR för att detektera rea för H. pylori-infektion och mutationer i 23S rRNA- och gyrA-generna, som kodar för resistens mot klaritromycin respektive levofloxacin. Jämfört med rutinmässigt använda odlingstekniker ger detta protokoll en icke-invasiv, billig och tidsbesparande teknik för att upptäcka H. pylori-infektion och bestämma dess antibiotikaresistens med qPCR.
Introduction
H. pylori är en spiralformad, mycket rörlig, gramnegativ bakterie som huvudsakligen lever i pylorusregionen i magen1. Det är en vanlig patogen som infekterar nästan 50% av den globala befolkningen2. De flesta människor med H. pylori-infektion har inga kliniska manifestationer, och de flesta utvecklar olika sjukdomar efter flera års infektion, inklusive kronisk gastrit, magsår, magsår och magcancer3. I flera studier baserade på olika populationer har effekten av att eliminera H. pylori för att förebygga magcancer och precancerösa lesioner visats 4,5. Därför har Världshälsoorganisationen (WHO) International Agency for Research on Cancer rekommenderat utrotning av H. pylori som en förebyggande åtgärd6.
Användningen av icke-invasiva metoder för att identifiera H. pylori-infektion är en nyckelkomponent i behandlingen för de flesta individer med asymtomatisk dyspepsi. Urea andningstest (UBT), H. pylori fekalt antigentest (SAT) och serologisk testning är populära icke-invasiva tekniker. Bland dessa är UBT det minst påträngande och mest exakta förfarandet som finns tillgängligt. UBT använder ureas, rikligt närvarande i H. pylori, för att hydrolysera isotopmärkt urea till ammoniak och koldioxid (13C eller 14C). Däremot är den immunokromatografiska analysen (ICA)7 bekväm, enkel och icke-invasiv för provtagning. Testets noggrannhet påverkas dock av flera faktorer, såsom kvaliteten på avföringsprovet, temperaturen och intervallet mellan provtagning och testning. Ett annat test baserat på immunsvaret är serum H. pylori-antikroppstestet, som detekterar antikroppar i patientens serum . Detta test är dock inte lämpligt för efterbehandlingsanalys eftersom antikropparna kvarstår långt efter att bakterierna har rensats8. En annan stor nackdel är att dessa metoder endast diagnostiserar H. pylori-infektion och inte tillåter läkemedelsresistenstestning för att styra känslighetsbaserad behandling.
För invasiva testmetoder måste gastrisk biopsivävnad tas genom endoskopi och sedan utsättas för histologi, ureas-snabbtestet och bakteriekultur. Dessa testmetoder är också mycket begränsade på grund av flera faktorer. För närvarande är dessa tekniker begränsade till äldre patienter, patienter med hög risk för precancerös eller malign sjukdom och patienter som har misslyckats med förstahandsbehandling för gastroesofageal refluxsjukdom eller H. pylori-infektion 9. För det andra, på grund av de unika tillväxtegenskaperna hos H. pylori, når framgångsgraden för bakteriekultur endast 50%10. Således erbjuder molekylära detektionsmetoder nytt hopp för att övervinna de höga kraven på invasiva detektionsmetoder och vägleda känslighetsbaserad behandling. Bland molekylära detektionsmetoder har kvantitativ PCR utvecklats enormt de senaste åren. qPCR, till skillnad från traditionell PCR, kräver inte gelelektrofores och kvantifierar exakt DNA / RNA i prover genom att tillsätta primers och sonder vid glödgningssteget. qPCR-kit för detektion av H. pylori-infektion och läkemedelsresistens är nu kommersiellt tillgängliga. Ändå har varje metod sina begränsningar; Därför bör en patients kliniska diagnos och behandling övervägas i samband med deras symtom, tecken, historia, andra laboratorietester och svar på behandlingen.
För närvarande tar den primära metoden för behandling av H.pylori-infektioner antibiotika, men på senare tid blir det allt svårare att behandla dessa infektioner på grund av ökningen av antibiotikaresistens. Därefter har en betydande minskning av H. pylori-behandlingseffekten observerats globalt, vilket gör utrotning av H. pylori till ett stort folkhälsoproblem11.
Klaritromycin och levofloxacin är de två bredspektrumantibiotika som används för att behandla infektioner orsakade av H. pylori, men flera studier har rapporterat utbredd resistens mot dessa två läkemedel i H. pylori-isolat. A2143G, A2142G och A2142C är tre av de många punktmutationer som finns i 2,9 kb 23S rRNA-genen som resulterar i klaritromycinresistens genom att förhindra makroliden från att binda. Samtidigt är mutationslokusen för levofloxacinresistensgenen huvudsakligen belägna i de sex mutationsställena (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) i gyrA-genen 12. Upptäckten av dessa resistensmekanismer baserade på genetiska mutationer har lett till en gradvis förskjutning av upptäckten av H. pylori genom kulturbaserade studier till molekylär testning.
Sammantaget finns det ett akut kliniskt behov av en icke-invasiv, effektiv och samtidig diagnostisk metod för detektion av H. pylori-infektioner och läkemedelsresistens. Vi antog ett kombinerat strängtest och qPCR-metod för att övervinna svårigheterna med provtagning och uppnå målet om samtidig detektion av H. pylori-infektion och läkemedelsresistens med olika primerprober.
Protocol
Representative Results
Discussion
H. pylori-detektion kan utföras med både invasiva och icke-invasiva metoder13. Vanliga invasiva tekniker som histopatologi, det snabba ureastestet, polymeraskedjereaktion (PCR) och bakterieodling kräver endoskopi och biopsi. Serologiska tester, urea-andningstester och enzymkopplade immunosorbentanalyser (ELISA) rekommenderas bland de icke-invasiva procedurerna14. Medan icke-invasiva metoder är lätta att utföra, ekonomiska och bekvämare för patienter, kräve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Sanming Project of Medicine i Shenzhen (Grant No. SZSM201510050) och Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (bidragsnummer 2022A1515220023). Forskningsstiftelsen för avancerade talanger vid Guandongprovinsens folksjukhus (nr. KJ012021097) och National Natural Science Foundation of China (81871734, 82072380, 82272423). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesignen, datainsamlingen och analysen, beslutet att publicera eller utarbetandet av manuskriptet.
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
- Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12 (2022).
- Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
- Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
- Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
- IARC Helicobacter pylori Working Group. . Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , (2014).
- Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
- Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection – The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
- Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
- Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393 (2021).
- Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
- Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
- Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
- DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
- Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
- Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).
