Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) Bazlı Helicobacter pylori Enfeksiyonu ve Antibiyotik Direncinin Hızlı Tanısı
Summary
Protokol, Helicobacter pylori mide enfeksiyonlarının ip testi ile hızlı teşhisi için noninvaziv bir yöntem sunar ve klaritromisin ve levofloksasine karşı antibiyotik direncini kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanarak belirler.
Abstract
Helicobacter pylori, küresel nüfusun yaklaşık yarısını enfekte eden ve artan antibiyotik direnci nedeniyle ciddi bir sağlık tehdidi haline gelen önemli bir insan patojenidir. Kronik aktif gastrit, peptik ülser hastalığı ve mide kanserinin etken maddesidir ve Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı tarafından Grup I Kanserojen olarak sınıflandırılmıştır. Bu nedenle, H. pylori’nin hızlı ve doğru tanısı ve antibiyotik direncinin belirlenmesi, bu bakteriyel patojenin etkin bir şekilde yok edilmesi için önemlidir. Günümüzde, H. pylori tanı yöntemleri temel olarak üre nefes testi (UBT), antijen testi, serum antikor testi, gastroskopi, hızlı üreaz testi (RUT) ve bakteri kültürünü içerir. Bunlar arasında, ilk üç tespit yöntemi invaziv değildir, yani yapılması kolay testlerdir. Bununla birlikte, bakteriler bu tekniklerle elde edilemez; Bu nedenle ilaç direnci testi yapılamaz. Son üçü invaziv muayenelerdir, ancak maliyetlidirler, yüksek beceri gerektirirler ve hastalara zarar verme potansiyeline sahiptirler. Bu nedenle, H. pylori tespiti ve ilaç direnci testi için noninvaziv, hızlı ve eşzamanlı bir yöntem, klinik pratikte H. pylori’nin etkin bir şekilde ortadan kaldırılması için çok önemlidir. Bu protokol, H. pylori enfeksiyonunun ve antibiyotik direncinin hızlı tespiti için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile kombinasyon halinde sicim testini içeren spesifik bir prosedür sunmayı amaçlamaktadır. Bakteriyel kültürlerin aksine, bu yöntem H. pylori enfeksiyon durumunun ve ilaç direncinin kolay, hızlı, invaziv olmayan teşhisine izin verir. Spesifik olarak, sırasıyla klaritromisin ve levofloksasine karşı direnci kodlayan 23S rRNA ve gyrA genlerindeki H. pylori enfeksiyonu ve mutasyonları için rea’yı tespit etmek için qPCR’yi kullandık. Rutin olarak kullanılan kültürleme teknikleriyle karşılaştırıldığında, bu protokol H. pylori enfeksiyonunu tespit etmek ve qPCR kullanarak antibiyotik direncini belirlemek için invaziv olmayan, düşük maliyetli ve zaman kazandıran bir teknik sağlar.
Introduction
H. pylori, esas olarak midenin pilor bölgesinde yaşayan spiral şekilli, oldukça hareketli, gram-negatif bir bakteridir1. Küresel nüfusun yaklaşık% 50’sini enfekte eden yaygın bir patojendir2. H. pylori enfeksiyonu olan çoğu insanın klinik belirtileri yoktur ve çoğu kronik gastrit, peptik ülser, mide ülseri ve mide kanseri dahil olmak üzere birkaç yıllık enfeksiyondan sonra farklı hastalıklar geliştirir3. Farklı popülasyonlara dayanan çeşitli çalışmalarda, mide kanseri ve prekanseröz lezyonları önlemede H. pylori’yi elimine etmenin etkinliği gösterilmiştir 4,5. Bu nedenle, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı, önleyici bir önlem olarak H. pylori eradikasyonunu tavsiye etmiştir6.
H. pylori enfeksiyonunu tanımlamak için noninvaziv yöntemlerin kullanılması, asemptomatik dispepsisi olan çoğu birey için tedavinin önemli bir bileşenidir. Üre nefes testi (UBT), H. pylori fekal antijen testi (SAT) ve serolojik testler popüler noninvaziv tekniklerdir. Bunlar arasında, UBT mevcut en az müdahaleci ve en doğru prosedürdür. UBT, izotopik olarak etiketlenmiş üreyi amonyak ve karbondioksite (13C veya 14C) hidrolize etmek için H. pylori’de bol miktarda bulunan üreaz kullanır. Buna karşılık, immünokromatografik tahlil (ICA)7 örnekleme için uygun, basit ve noninvazivdir. Bununla birlikte, testin doğruluğu, dışkı numunesinin kalitesi, sıcaklık ve numune toplama ile test arasındaki aralık gibi çeşitli faktörlerden etkilenir. İmmün cevaba dayanan bir başka test, hastanın serumundaki antikorları tespit eden serum H. pylori antikor testidir. Bununla birlikte, bu test tedavi sonrası analiz için uygun değildir, çünkü antikorlar bakteriler temizlendikten sonra uzun süre kalır8. Bir diğer önemli dezavantaj, bu yöntemlerin sadece H. pylori enfeksiyonunu teşhis etmesi ve duyarlılığa dayalı tedaviyi yönlendirmek için ilaç direnci testine izin vermemesidir.
İnvaziv test yöntemleri için, mide biyopsi dokusunun endoskopi ile alınması ve daha sonra histolojiye, üreaz hızlı testine ve bakteri kültürüne tabi tutulması gerekir. Bu test yöntemleri de çeşitli faktörler nedeniyle çok sınırlıdır. Günümüzde bu teknikler yaşlı hastalar, prekanseröz veya malign hastalık için yüksek risk altındaki hastalar ve gastroözofageal reflü hastalığı veya H. pylori enfeksiyonu9 için birinci basamak tedavide başarısız olan hastalar ile sınırlıdır. İkincisi, H. pylori’nin benzersiz büyüme özellikleri nedeniyle, bakteri kültürünün başarı oranı sadece% 50’ye ulaşır10. Bu nedenle, moleküler tespit yöntemleri, invaziv tespit yöntemlerinin yüksek taleplerinin üstesinden gelmek ve duyarlılığa dayalı tedaviye rehberlik etmek için yeni umutlar sunmaktadır. Moleküler tespit yöntemleri arasında, kantitatif PCR son yıllarda muazzam bir şekilde gelişmiştir. qPCR, geleneksel PCR’den farklı olarak, jel elektroforezi gerektirmez ve tavlama aşamasında primerler ve problar ekleyerek numunelerdeki DNA / RNA’yı doğru bir şekilde ölçer. H. pylori enfeksiyonunun ve ilaç direncinin tespiti için qPCR kitleri artık ticari olarak temin edilebilir. Bununla birlikte, her yöntemin kendi sınırlamaları vardır; Bu nedenle, bir hastanın klinik tanı ve tedavisi, semptomları, bulguları, öyküsü, diğer laboratuvar testleri ve tedaviye yanıtı ile birlikte düşünülmelidir.
Şu anda, H.pylori enfeksiyonlarını tedavi etmenin birincil yöntemi antibiyotik almaktır, ancak son zamanlarda, antibiyotik direncindeki artış nedeniyle bu enfeksiyonları tedavi etmek giderek zorlaşmaktadır. Daha sonra, H. pylori tedavisinin etkinliğinde küresel olarak önemli bir düşüş gözlenmiştir ve bu da H. pylori eradikasyonunu önemli bir halk sağlığı sorunu haline getirmiştir11.
Klaritromisin ve levofloksasin, H.pylori’nin neden olduğu enfeksiyonları tedavi etmek için kullanılan iki geniş spektrumlu antibiyotiktir, ancak birkaç çalışma H.pylori izolatlarında bu iki ilaca karşı yaygın direnç bildirmiştir. A2143G, A2142G ve A2142C, makrolidin bağlanmasını önleyerek klaritromisin direnci ile sonuçlanan 2.9 kb 23S rRNA geninde bulunan çok sayıda nokta mutasyonundan üçüdür. Aynı zamanda, levofloksasin direnç geninin mutasyon lokusları esas olarak gyrA geni12’nin altı mutasyon bölgesinde (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) bulunur. Genetik mutasyonlara dayanan bu direnç mekanizmalarının keşfi, kültürel temelli çalışmalarla H. pylori’nin tespitinde moleküler testlere kademeli bir kaymaya yol açmıştır.
Genel olarak, H. pylori enfeksiyonlarının ve ilaç direncinin saptanması için noninvaziv, etkili ve eşzamanlı bir tanı yöntemine acil bir klinik ihtiyaç vardır. Örneklemenin zorluklarının üstesinden gelmek ve farklı primer problar kullanarak H. pylori enfeksiyonunun ve ilaç direncinin eşzamanlı tespiti hedefine ulaşmak için kombine bir sicim testi ve qPCR yöntemini benimsedik.
Protocol
Representative Results
Discussion
H. pylori tespiti hem invaziv hem de noninvaziv yöntemler kullanılarak yapılabilir13. Histopatoloji, hızlı üreaz testi, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve bakteriyel kültürleme gibi yaygın olarak kullanılan invaziv teknikler endoskopi ve biyopsi gerektirir. Serolojik testler, üre nefes testleri ve enzime bağlı immünosorbent testleri (ELISA) noninvaziv prosedürler arasında önerilmektedir14. Noninvaziv yöntemlerin uygulanması kolay, ekonomik ve h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Shenzhen’deki Sanming Tıp Projesi tarafından desteklenmiştir (Hibe No. SZSM201510050) ve Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (Hibe No. 2022A1515220023). Guandong İl Halk Hastanesi İleri Yetenekler Araştırma Vakfı (No. KJ012021097) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81871734, 82072380, 82272423). Fon sağlayıcıların çalışmanın tasarımında, veri toplama ve analizinde, yayınlama kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
- Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12 (2022).
- Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
- Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
- Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
- IARC Helicobacter pylori Working Group. . Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , (2014).
- Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
- Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection – The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
- Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
- Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393 (2021).
- Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
- Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
- Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
- DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
- Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
- Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).
