प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से निलंबन में किडनी ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करना
Summary
यह प्रोटोकॉल निलंबन संस्कृति स्थितियों का उपयोग करके प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से किडनी ऑर्गेनोइड ्स के उत्पादन के लिए एक व्यापक और कुशल विधि प्रस्तुत करता है। इस अध्ययन का प्राथमिक जोर प्रारंभिक सेल घनत्व और डब्ल्यूएनटी एगोनिस्ट एकाग्रता के निर्धारण में निहित है, जिससे किडनी ऑर्गेनॉइड अनुसंधान में रुचि रखने वाले जांचकर्ताओं को लाभ होता है।
Abstract
किडनी ऑर्गेनोइड्स को विभिन्न दृष्टिकोणों के माध्यम से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से उत्पन्न किया जा सकता है। ये ऑर्गेनोइड रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग और संभावित चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए बहुत वादा करते हैं। यह लेख आईपीएससी से किडनी ऑर्गेनोइड बनाने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रस्तुत करता है, जो पश्चवर्ती आदिम लकीर (पीएस) से मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) तक शुरू होता है। दृष्टिकोण एपीईएल 2 माध्यम पर निर्भर करता है, जो एक परिभाषित, पशु घटक-मुक्त माध्यम है। यह 4 दिनों की अवधि के लिए डब्ल्यूएनटी एगोनिस्ट (CHIR99021) की उच्च सांद्रता के साथ पूरक है, इसके बाद फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 9 (एफजीएफ 9)/हेपरिन और अतिरिक्त 3 दिनों के लिए CHIR99021 की कम सांद्रता होती है। इस प्रक्रिया के दौरान, आईपीएससी की शुरुआत में इष्टतम सेल घनत्व और CHIR99021 एकाग्रता का चयन करने पर जोर दिया जाता है, क्योंकि ये कारक सफल किडनी ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू एक कम अनुयायी प्लेट में निलंबन संस्कृति है, जिससे आईएम को धीरे-धीरे नेफ्रॉन संरचनाओं में विकसित होने की अनुमति मिलती है, जिसमें ग्लोमेरुलर, समीपस्थ ट्यूबलर और डिस्टल ट्यूबलर संरचनाएं शामिल हैं, जो सभी एक नेत्रहीन बोधगम्य प्रारूप में प्रस्तुत की जाती हैं। कुल मिलाकर, यह विस्तृत प्रोटोकॉल विभिन्न आईपीएससी से किडनी ऑर्गेनोइड का उत्पादन करने के लिए एक कुशल और विशिष्ट तकनीक प्रदान करता है, जो सफल और सुसंगत परिणाम सुनिश्चित करता है।
Introduction
किडनी अपनी कार्यात्मक इकाई के आधार पर शारीरिक होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। नेफ्रॉन, जो अपशिष्ट उत्पादों को उत्सर्जित करते हैं, शरीर के तरल पदार्थों की संरचना को नियंत्रित कर सकते हैं। वंशानुगत उत्परिवर्तन या अन्य उच्च जोखिम वाले कारकों के कारण क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी), अंततः अंतिम चरण गुर्दे की बीमारी (ईएसकेडी) 1,2 में प्रगति करेगा। ईएसकेडी स्पष्ट रूप से नेफ्रॉन की सीमित पुनर्जनन क्षमता के कारण है। इस प्रकार, गुर्दे की प्रतिस्थापन चिकित्सा की आवश्यकता होती है। मानव आईपीएससी का निर्देशित भेदभाव रोगी-विशिष्ट 3 डी किडनी ऑर्गेनोइड्स की इन विट्रो पीढ़ी को सक्षम बनाता है, जिसका उपयोग गुर्दे के विकास का अध्ययन करने, रोगी-विशिष्ट बीमारियों को मॉडल करने और नेफ्रोटॉक्सिक दवा स्क्रीनिंग 3,4 करने के लिए किया जा सकता है।
भ्रूण के विकास के दौरान, गुर्दे मध्यवर्ती मेसोडर्म (आईएम) से उत्पन्न होते हैं, जो आदिम लकीर (पीएस) से अलग होता है। शास्त्रीय डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग मार्ग एफजीएफ (एफजीएफ 9, एफजीएफ 20) और बीएमपी (जेएनके के माध्यम से बीएमपी 7 सिग्नलिंग) 5,6,7 की समन्वित भागीदारी के साथ आईएम के अतिरिक्त भेदभाव को प्रेरित कर सकता है। वे नेफ्रिक पूर्वज कोशिकाओं (एनपीसी) की दो महत्वपूर्ण कोशिका आबादी का उत्पादन करते हैं: मूत्रवाहिनी कली (यूबी), और मेटानेफ्रिक मेसेनचाइम (एमएम), क्रमशः 8,9 एकत्र नलिकाओं और नेफ्रॉन का निर्माण करते हैं। प्रत्येक नेफ्रॉन में ग्लोमेरुलर और ट्यूबलर खंड होते हैं, जैसे कि समीपस्थ और डिस्टल नलिकाएं, और हेनले10,11 का लूप। ऊपर उल्लिखित सिद्धांत के अनुसार, वर्तमान में प्रकाशित प्रोटोकॉल किडनी ऑर्गेनोइड्स 5,12 को प्रेरित करने के लिए सिग्नल कैस्केड और विकास कारक उत्तेजना की नकल करते हैं।
पिछले कई वर्षों में, मानव आईपीएससी को किडनी ऑर्गेनोइड्स 5,6,7,12 में अलग करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। Takasato et al.7 ने FGF9 द्वारा प्रतिस्थापन से पहले CHIR (WNT एगोनिस्ट) उपचार की अवधि को अनुकूलित किया। उनके प्रोटोकॉल के अनुसार, 4 दिनों के लिए सीएचआईआर एक्सपोजर, उसके बाद 3 दिनों के लिए एफजीएफ 9, आईपीएससी से आईएम को प्रेरित करने का सबसे प्रभावी तरीका है। ट्रांसवेल फिल्टर को उनकी प्रक्रिया में संस्कृति प्रारूप के रूप में उपयोग किया गया था; हालांकि, यह विधि शुरुआती लोगों के लिए मुश्किल है। इसलिए, कुमार एट अल .13 ने संस्कृति प्रारूप को बदलने की कोशिश की और संस्कृति को निलंबित करने का विकल्प चुना। उन्होंने 7 वें दिन अनुयायी कोशिकाओं को कम अनुगामी प्लेटों में बीज बोने के लिए अलग कर दिया ताकि उन्हें भ्रूण के शरीर (ईबी) में इकट्ठा करने में मदद मिल सके जिसमें नेफ्रॉन जैसी संरचनाएं होती हैं। हालांकि, इन विधियों का बैच प्रभाव स्पष्ट था, खासकर विभिन्न आईपीएससी में। इसके अतिरिक्त, विभिन्न साहित्य ों ने बताया कि सीएचआईआर की एकाग्रता 7 μM से 12 μM 5,13,14 तक भिन्न होती है।
हमने अनुमान लगाया कि सेल घनत्व और सीएचआईआर की एकाग्रता विभिन्न आईपीएससी में ऑर्गेनोइड ्स की पीढ़ी को प्रभावित कर सकती है, और यह हमारे प्रयोगों में कई बार सत्यापित किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल ने कुमार एट अल.13 की अध्ययन विधि को थोड़ा संशोधित किया है और उपयोगकर्ताओं को चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान की है। दृष्टिकोण की अनुसूची और योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाए गए हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईपीएससी से किडनी ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जिसमें बेसल माध्यम, प्रारंभिक सेल घनत्व और CHIR99021 की एकाग्रता में मामूली संशोधन शामिल हैं। विभिन्न प्रयोगों ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम परियोजना में दिलचस्प चर्चा और महान योगदान के लिए सभी माओ और हू लैब सदस्यों, अतीत और वर्तमान के लिए बेहद आभारी हैं। हम महान समर्थन के लिए बाल स्वास्थ्य के लिए राष्ट्रीय नैदानिक अनुसंधान केंद्र को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (जियानहुआ माओ के U20A20351, लिदान हू के 82200784), चीन के झेजियांग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था । LQ22C070004 लिदान हू), और जियांग्सू प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान सं। BK20210150 गैंग वांग के लिए)।
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
References
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