Extraction d’ADN acellulaire d’échantillons d’humeur vitréenne et aqueuse pour le diagnostic et la surveillance du lymphome vitréo-rétinien
Summary
Une procédure d’extraction de l’ADN acellulaire de l’humeur vitréenne et aqueuse pour effectuer des études moléculaires pour diagnostiquer le lymphome vitréo-rétinien est établie ici. La méthode offre la possibilité d’extraire simultanément l’ADN de la composante cellulaire de l’échantillon ou de le réserver pour des tests auxiliaires.
Abstract
Le lymphome vitréo-rétinien (VRL) représente un lymphome agressif, souvent classé comme lymphome diffus à grandes cellules B du système nerveux central. Pour diagnostiquer la VRL, des échantillons tels que l’humeur vitrée et, plus récemment, l’humeur aqueuse sont collectés. Les tests diagnostiques de VRL sur ces échantillons comprennent la cytologie, la cytométrie en flux et les tests moléculaires. Cependant, la cytopathologie et la cytométrie en flux, ainsi que les tests moléculaires utilisant l’ADN cellulaire, nécessitent des cellules entières intactes. Le défi réside dans le fait que l’humeur vitrée et l’humeur aqueuse ont généralement une faible cellularité et que de nombreuses cellules sont détruites lors de la collecte, du stockage et du traitement. De plus, ces échantillons posent des difficultés supplémentaires pour les tests moléculaires en raison de la viscosité élevée de l’humeur vitrée et du faible volume de l’humeur vitrée et aqueuse. Cette étude propose une méthode d’extraction de l’ADN acellulaire à partir d’échantillons vitrés et aqueux. Cette approche complète l’extraction de l’ADN cellulaire ou permet d’utiliser la composante cellulaire de ces échantillons pour d’autres méthodes de diagnostic, notamment la cytologie et la cytométrie en flux.
Introduction
Le lymphome vitréo-rétinien (VRL) est un lymphome agressif associé à un lymphome diffus à grandes cellules B du système nerveux central 1,2,3. La VRL est généralement mortelle en raison de son implication dans le système nerveux central 1,2. Bien que rare1,4, le VRL présente souvent des symptômes similaires à ceux de l’uvéite postérieure et d’autres maladies vitréo-rétiniennes 4,5. Par conséquent, les patients présentant des symptômes d’uvéite ont besoin d’un diagnostic pour confirmer ou infirmer la VRL.
Récemment, des critères consensuels pour le diagnostic de la VRL ont été publiés, qui impliquent une combinaison d’examen clinique et de résultats de laboratoire6. Les échantillons couramment utilisés pour diagnostiquer la VRL comprennent l’humeur vitrée et, plus récemment, l’humeur aqueuse7. L’humeur vitrée est obtenue par une intervention chirurgicale appelée vitrectomie pars plana, qui permet d’accéder au segment postérieur de l’œil8.
Dans le protocole présenté, des échantillons d’humeur aqueuse et d’humeur vitrée ont été prélevés pour l’extraction cellulaire et l’ADNcf. Après anesthésier les patients et placer des trocarts à environ 4 mm du limbe cornéen, un échantillon d’humeur aqueuse d’environ 100 à 200 μL a été obtenu à l’aide d’une seringue à tuberculine de 1 mL au niveau du limbe cornéen. Pour les patients pseudophaques, le vitré non dilué a été obtenu en introduisant de l’air stérile dans la perfusion, ce qui a permis de recueillir une plus grande quantité de vitré non dilué (jusqu’à 3,5 ml). Chez les patients phaques, environ 500 à 1000 μL de vitré non dilué ont été retirés avant d’activer une perfusion de solution saline équilibrée. Dans certains cas, du vitré dilué secondairement (500 à 2 000 μL) a été prélevé en changeant la perfusion en liquide et en plaçant le vitrecteur dans la jupe vitréenne pour obtenir cet échantillon. La fraction vitréenne la plus diluée a été recueillie en conservant le sac de cassette (figure supplémentaire 1) à la fin de l’opération. Une fois que ce sac est arrivé au service de pathologie, le vitré dilué a été obtenu en drainant le liquide de ce sac dans des tubes coniques pour l’extraction ultérieure de l’ADN.
La cytopathologie du liquide vitré est souvent considérée comme l’étalon-or9. Cependant, plusieurs études ont démontré une sensibilité limitée en raison du traitement et d’une cellularité minimale10,11,12. La cytométrie en flux peut aider à identifier les lymphocytes B clonaux, mais peut également être limitée par une faible cellularité et la fragilité des grandes cellules de lymphome13,14,15. La cytopathologie et la cytométrie en flux nécessitent toutes deux des cellules entières intactes. Beaucoup de ces cellules sont détruites lors de la collecte, de l’entreposage et du traitement. Lorsque les tests moléculaires sont effectués à partir d’ADN extrait de cellules intactes (ADN cellulaire), ils souffrent de cette même limitation. De plus, la division de l’échantillon vitreux limité pour tous ces tests réduit la quantité de matériel disponible pour chaque test.
L’ADN acellulaire (cfDNA) représente une autre source d’ADN qui ne nécessite pas de cellules intactes. L’ADNcf provenant d’échantillons de vitré a été utilisé pour la détection du VRL 16,17 ainsi que du mélanome uvéal18. Dans ce protocole, l’ADN cellulaire et acellulaire est extrait du liquide vitré et aqueux pour détecter le VRL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le lymphome vitréo-rétinien (VRL) est un lymphome agressif à grandes cellules B 1,2,3 dont les symptômes peuvent imiter ceux d’autres maladies vitréo-rétiniennes 4,5. Les tests moléculaires de l’humeur vitrée et, plus récemment, aqueuse sont devenus une méthode essentielle pour poser le diagnostic de VRL ou l’exclure. Cependant, ces fluides sont très fai…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS, et Helmut Weigelin, MLS(ASCP) ont joué un rôle déterminant dans l’établissement de cette méthode d’extraction au sein de notre laboratoire.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
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