निदान और vitreoretinal लिंफोमा की निगरानी के लिए कांच का और जलीय हास्य नमूनों के सेल मुक्त डीएनए निष्कर्षण
Summary
विटेरोरेटिनल लिंफोमा के निदान के लिए आणविक अध्ययन करने के लिए कांच और जलीय हास्य से सेल-मुक्त डीएनए निकालने की एक प्रक्रिया यहां स्थापित की गई है। विधि नमूने के सेलुलर घटक से डीएनए को समवर्ती रूप से निकालने या सहायक परीक्षण के लिए इसे आरक्षित करने की क्षमता प्रदान करती है।
Abstract
विटेरोरेटिनल लिंफोमा (वीआरएल) एक आक्रामक लिंफोमा का प्रतिनिधित्व करता है, जिसे अक्सर प्राथमिक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के रूप में वर्गीकृत किया जाता है जो बड़े बी-सेल लिंफोमा को फैलाता है। वीआरएल का निदान करने के लिए, कांच के हास्य और हाल ही में, जलीय हास्य जैसे नमूने एकत्र किए जाते हैं। इन नमूनों पर वीआरएल के लिए नैदानिक परीक्षण में कोशिका विज्ञान, प्रवाह साइटोमेट्री और आणविक परीक्षण शामिल हैं। हालांकि, सेलुलर डीएनए का उपयोग करके आणविक परीक्षण के साथ-साथ साइटोपैथोलॉजी और प्रवाह साइटोमेट्री दोनों को बरकरार पूरे कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। चुनौती इस तथ्य में निहित है कि कांच और जलीय हास्य में आमतौर पर कम सेल्युलरिटी होती है, और संग्रह, भंडारण और प्रसंस्करण के दौरान कई कोशिकाएं नष्ट हो जाती हैं। इसके अलावा, ये नमूने कांच के हास्य की उच्च चिपचिपाहट और कांच और जलीय हास्य दोनों की कम मात्रा के कारण आणविक परीक्षण के लिए अतिरिक्त कठिनाइयों का सामना करते हैं। यह अध्ययन कांच और जलीय नमूनों से सेल-मुक्त डीएनए निकालने के लिए एक विधि का प्रस्ताव करता है। यह दृष्टिकोण सेलुलर डीएनए के निष्कर्षण का पूरक है या इन नमूनों के सेलुलर घटक को कोशिका विज्ञान और प्रवाह साइटोमेट्री सहित अन्य नैदानिक विधियों के लिए उपयोग करने की अनुमति देता है।
Introduction
विटेरोरेटिनल लिंफोमा (वीआरएल) एक आक्रामक लिंफोमा है जो प्राथमिक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र फैलाना बड़े बी-सेल लिंफोमा 1,2,3 से जुड़ा है। वीआरएल आमतौर पर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र 1,2 में शामिल होने के कारण घातक है। हालांकि दुर्लभ1,4, वीआरएल अक्सर पश्चवर्ती यूवेइटिस और अन्य विटेरोरेटिनल रोगों 4,5 के समान लक्षणों के साथ प्रस्तुत करता है। नतीजतन, यूवाइटिस के लक्षणों का प्रदर्शन करने वाले रोगियों को वीआरएल की पुष्टि या शासन करने के लिए निदान की आवश्यकता होती है।
हाल ही में, वीआरएल के निदान के लिए सर्वसम्मति मानदंड प्रकाशित किए गए थे, जिसमें नैदानिक परीक्षा औरप्रयोगशाला निष्कर्षों का संयोजन शामिल है। आमतौर पर वीआरएल का निदान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूनों में कांच का हास्य और, हाल ही में, जलीय हास्य7 शामिल हैं। कांच का हास्य पार्स प्लाना विट्रोक्टोमी नामक एक शल्य प्रक्रिया के माध्यम से प्राप्त किया जाता है, जो आंख के पीछे के खंड तक पहुंच की अनुमति देता है8.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, दोनों जलीय हास्य और कांच का हास्य नमूने सेलुलर और cfDNA निष्कर्षण के लिए एकत्र किए गए थे. रोगियों को एनेस्थेटाइज़ करने और कॉर्नियल लिंबस से लगभग 4 मिमी ट्रोकार्स रखने के बाद, कॉर्नियल लिंबस में 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज का उपयोग करके लगभग 100-200 माइक्रोन का एक जलीय हास्य नमूना प्राप्त किया गया था। स्यूडोफैकिक रोगियों के लिए, जलसेक में बाँझ हवा को पेश करके undiluted vitreous प्राप्त किया गया था, जिससे बड़ी मात्रा में undiluted vitreous (3.5 mL तक) का संग्रह सक्षम हो गया। फाकिक रोगियों में, संतुलित नमक समाधान के जलसेक को चालू करने से पहले लगभग 500 से 1000 माइक्रोन undiluted vitreous को हटा दिया गया था। कुछ मामलों में, द्वितीयक रूप से पतला कांच का (500 से 2,000 μL) जलसेक को तरल पदार्थ में बदलकर और इस नमूने को प्राप्त करने के लिए विट्रेक्टर को कांच की स्कर्ट के भीतर रखकर एकत्र किया गया था। सर्जरी के अंत में कैसेट बैग (पूरक चित्रा 1) को संरक्षित करके सबसे पतला कांच का अंश एकत्र किया गया था। एक बार जब यह बैग पैथोलॉजी विभाग में पहुंच गया, तो बाद में डीएनए निष्कर्षण के लिए शंक्वाकार ट्यूबों में इस बैग से तरल पदार्थ निकालने से पतला कांच प्राप्त किया गया।
कांच के तरल पदार्थ के साइटोपैथोलॉजी को अक्सर स्वर्ण मानक9 माना जाता है। हालांकि, कई अध्ययनों ने प्रसंस्करण और न्यूनतम सेल्युलरता10,11,12 के कारण सीमित संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया है। फ्लो साइटोमेट्री क्लोनल बी-कोशिकाओं की पहचान करने में सहायता कर सकती है, लेकिन कम सेल्युलरिटी और बड़े लिम्फोमा कोशिकाओं की नाजुकता13,14,15द्वारा भी सीमित किया जा सकता है। साइटोपैथोलॉजी और फ्लो साइटोमेट्री दोनों को बरकरार पूरे कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इनमें से कई कोशिकाएं संग्रह, भंडारण और प्रसंस्करण के दौरान नष्ट हो जाती हैं। जब आणविक परीक्षण बरकरार कोशिकाओं (सेलुलर डीएनए) से निकाले गए डीएनए का उपयोग करके किया जाता है, तो यह इसी सीमा से ग्रस्त होता है। इसके अलावा, इन सभी परीक्षणों के लिए सीमित कांच के नमूने को विभाजित करने से प्रत्येक परीक्षण के लिए उपलब्ध सामग्री की मात्रा कम हो जाती है।
सेल-फ्री डीएनए (सीएफडीएनए) डीएनए के एक अन्य स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है जिसे बरकरार कोशिकाओं की आवश्यकता नहीं होती है। कांच के नमूनों से cfDNA वीआरएल 16,17 के साथ-साथ यूवील मेलेनोमा18 का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, सेलुलर और सेल मुक्त डीएनए वीआरएल का पता लगाने के लिए कांच और जलीय तरल पदार्थ से निकाला जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विटेरोरेटिनल लिंफोमा (वीआरएल) एक आक्रामक बड़े बी-सेल लिंफोमा 1,2,3 है जिनके लक्षण अन्य विटेरोरेटिनल रोगों की नकल कर सकते हैं 4,5. कांच का आणविक परीक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
टिमोथी डेनियल, एमएलएस (एएससीपी), एमबी, क्यूएलएस, और हेल्मुट वीगेलिन, एमएलएस (एएससीपी) हमारी प्रयोगशाला के भीतर इस निष्कर्षण विधि को स्थापित करने में सहायक थे।
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
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