Estrazione di DNA senza cellule di campioni di vitreo e umor acqueo per la diagnosi e il monitoraggio del linfoma vitreoretinico
Summary
Qui viene stabilita una procedura per estrarre il DNA privo di cellule dall’umor vitreo e acqueo per eseguire studi molecolari per la diagnosi di linfoma vitreoretinico. Il metodo offre la possibilità di estrarre contemporaneamente il DNA dalla componente cellulare del campione o di riservarlo per test ausiliari.
Abstract
Il linfoma vitreoretinico (VRL) rappresenta un linfoma aggressivo, spesso classificato come linfoma primario diffuso a grandi cellule B del sistema nervoso centrale. Per diagnosticare il VRL, vengono raccolti campioni come l’umor vitreo e, più recentemente, l’umor acqueo. I test diagnostici per VRL su questi campioni includono citologia, citometria a flusso e test molecolari. Tuttavia, sia la citopatologia che la citometria a flusso, insieme ai test molecolari che utilizzano il DNA cellulare, richiedono cellule intere intatte. La sfida risiede nel fatto che l’umor vitreo e acqueo hanno in genere una bassa cellularità e molte cellule vengono distrutte durante la raccolta, la conservazione e l’elaborazione. Inoltre, questi campioni pongono ulteriori difficoltà per i test molecolari a causa dell’elevata viscosità dell’umor vitreo e del basso volume sia dell’umor vitreo che dell’umor acqueo. Questo studio propone un metodo per estrarre DNA privo di cellule da campioni vitrei e acquosi. Questo approccio integra l’estrazione del DNA cellulare o consente di utilizzare la componente cellulare di questi campioni per altri metodi diagnostici, tra cui la citologia e la citometria a flusso.
Introduction
Il linfoma vitreoretinico (VRL) è un linfoma aggressivo associato al linfoma primario a grandi cellule B diffuso del sistema nervoso centrale 1,2,3. Il VRL è tipicamente fatale a causa del suo coinvolgimento nel sistema nervoso centrale 1,2. Sebbene rara1,4, la VRL si presenta spesso con sintomi simili all’uveite posteriore e ad altre malattie vitreoretiniche 4,5. Di conseguenza, i pazienti che presentano sintomi di uveite richiedono una diagnosi per confermare o escludere la VRL.
Recentemente, sono stati pubblicati i criteri di consenso per la diagnosi di VRL, che comportano una combinazione di esame clinico e risultati di laboratorio6. I campioni comunemente usati per diagnosticare il VRL includono l’umor vitreo e, più recentemente, l’umor acqueo7. L’umor vitreo si ottiene attraverso una procedura chirurgica chiamata vitrectomia pars plana, che consente l’accesso al segmento posteriore dell’occhio8.
Nel protocollo presentato, sono stati raccolti campioni di umor acqueo e umor vitreo per l’estrazione cellulare e cfDNA. Dopo aver anestetizzato i pazienti e posizionato trocar a circa 4 mm dal limbus corneale, è stato ottenuto un campione di umore acqueo di circa 100-200 μL utilizzando una siringa di tubercolina da 1 mL nel limbus corneale. Per i pazienti pseudofachici, il vitreo non diluito è stato ottenuto introducendo aria sterile nell’infusione, consentendo la raccolta di una maggiore quantità di vitreo non diluito (fino a 3,5 ml). Nei pazienti fachici, circa 500-1000 μL di vitreo non diluito sono stati rimossi prima di attivare un’infusione di soluzione salina bilanciata. In alcuni casi, il vitreo diluito secondariamente (da 500 a 2.000 μL) è stato raccolto commutando l’infusione in liquido e posizionando il vitrector all’interno della gonna vitreale per ottenere questo campione. La frazione vitreale più diluita è stata raccolta conservando la sacca a cassetta (Figura supplementare 1) alla fine dell’intervento. Una volta che questa sacca ha raggiunto il reparto di patologia, il vitreo diluito è stato ottenuto drenando il liquido da questa sacca in provette coniche per la successiva estrazione del DNA.
La citopatologia del liquido vitreo è spesso considerata il gold standard9. Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato una sensibilità limitata a causa dell’elaborazione e della cellularità minima10,11,12. La citometria a flusso può aiutare a identificare le cellule B clonali, ma può anche essere limitata dalla bassa cellularità e dalla fragilità delle grandi cellule di linfoma13,14,15. Sia la citopatologia che la citometria a flusso richiedono cellule intere intatte. Molte di queste cellule vengono distrutte durante la raccolta, lo stoccaggio e l’elaborazione. Quando i test molecolari vengono eseguiti utilizzando DNA estratto da cellule intatte (DNA cellulare), soffre di questa stessa limitazione. Inoltre, dividendo il campione vitreo limitato per tutti questi test si riduce la quantità di materiale disponibile per ogni test.
Il DNA libero da cellule (cfDNA) rappresenta un’altra fonte di DNA che non richiede cellule intatte. Il cfDNA da campioni vitrei è stato utilizzato per la rilevazione di VRL 16,17 e melanoma uveale18. In questo protocollo, il DNA cellulare e privo di cellule viene estratto dal liquido vitreo e acquoso per rilevare il VRL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il linfoma vitreoretinico (VRL) è un linfoma aggressivo a grandi cellule B 1,2,3 i cui sintomi possono imitare altre malattie vitreoretiniche 4,5. I test molecolari dell’umor vitreo e, più recentemente, dell’umor acqueo sono diventati un metodo fondamentale per fare la diagnosi di VRL o escluderlo. Tuttavia, questi fluidi hanno un volume molto basso e spesso hanno una …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Timothy Daniels, MLS (ASCP), MB, QLS e Helmut Weigelin, MLS (ASCP) sono stati determinanti nella definizione di questo metodo di estrazione all’interno del nostro laboratorio.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
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