유리체 망막 림프종의 진단 및 모니터링을 위한 유리체 및 수성 체액 검체의 Cell-Free DNA 추출
Summary
유리체 및 수액에서 cell-free DNA를 추출하여 유리체 망막 림프종 진단을 위한 분자 연구를 수행하는 절차가 여기에 확립되어 있습니다. 이 방법은 샘플의 세포 구성 요소에서 DNA를 동시에 추출하거나 보조 테스트를 위해 비축할 수 있는 기능을 제공합니다.
Abstract
유리체 망막 림프종(VRL)은 종종 원발성 중추신경계 미만성 거대 B세포 림프종으로 분류되는 공격성 림프종을 나타냅니다. VRL을 진단하기 위해 유리체액과 최근에는 수액과 같은 표본을 수집합니다. 이러한 검체에 대한 VRL 진단 테스트에는 세포학, 유세포 분석 및 분자 테스트가 포함됩니다. 그러나 세포 병리학 및 유세포 분석은 세포 DNA를 사용한 분자 검사와 함께 온전한 전체 세포를 필요로 합니다. 문제는 유리체와 수액이 일반적으로 세포성이 낮고 많은 세포가 수집, 저장 및 처리 중에 파괴된다는 사실에 있습니다. 더욱이, 이러한 시편은 유리체액의 높은 점도와 유리체 및 수액의 부피가 적기 때문에 분자 테스트에 추가적인 어려움을 초래합니다. 본 연구는 유리체 및 수성 검체에서 cell-free DNA를 추출하는 방법을 제안한다. 이 접근법은 세포 DNA 추출을 보완하거나 이러한 검체의 세포 구성 요소를 세포학 및 유세포 분석을 포함한 다른 진단 방법에 활용할 수 있도록 합니다.
Introduction
유리체 망막 림프종(VRL)은 원발성 중추신경계 미만성 거대 B세포 림프종 1,2,3과 관련된 공격적인 림프종입니다. VRL은 일반적으로 중추 신경계에 관여하기 때문에 치명적이다 1,2. 드물기는 하지만1,4, VRL은 종종 후포도막염 및 기타 유리체 망막 질환과 유사한 증상을 나타낸다 4,5. 따라서 포도막염 증상을 보이는 환자는 VRL을 확인하거나 배제하기 위한 진단이 필요합니다.
최근에는 VRL 진단에 대한 합의된 기준이 발표되었는데, 여기에는 임상 검사와 실험실 결과의 조합이 포함된다6. VRL을 진단하는 데 일반적으로 사용되는 검체에는 유리체액(vitreous humor)이 있으며, 최근에는 수액(aqueous humor)7이 있다. 유리체액은 유리체 절제술(pars plana vitrectomy)이라고 불리는 수술을 통해 얻을 수 있으며, 이를 통해 눈의 후방 분절에 접근할 수 있다8.
제시된 프로토콜에서, 수성 체액 및 유리체 체액 표본 모두 세포 및 cfDNA 추출을 위해 수집되었습니다. 환자를 마취하고 각막 림부로부터 약 4mm 떨어진 곳에 투관침을 배치한 후, 각막 림부에서 1mL 투베르쿨린 주사기를 사용하여 약 100-200μL의 수액 샘플을 얻었다. pseudophakic 환자의 경우, 무균 공기를 주입에 도입하여 희석되지 않은 유리체를 얻었고, 더 많은 양의 희석되지 않은 유리체(최대 3.5mL)를 수집할 수 있었습니다. phakic 환자에서, 대략 500 내지 1000 μL의 희석되지 않은 유리체를 제거한 후 균형 잡힌 염 용액을 주입하였다. 몇몇 경우에, 2차적으로 희석된 유리체(500 내지 2,000 μL)를 주입액으로 전환하고 유리체 스커트 내에 유리체를 배치하여 이 샘플을 수득하였다. 가장 희석된 유리체 분획은 수술 종료 시 카세트 백(보충 그림 1)을 보존하여 수집했습니다. 이 백이 병리학 부서에 도착하면, 후속 DNA 추출을 위해 이 백에서 유체를 원뿔형 튜브로 배출하여 묽은 유리체를 얻었습니다.
유리체액의 세포병리학(cytopathology)은 종종 황금 표준(gold standard)으로 간주된다9. 그러나 여러 연구에서 처리 및 최소 세포성으로 인해 제한된 감도가 입증되었습니다10,11,12. 유세포 분석은 클론 B-세포를 식별하는 데 도움이 될 수 있지만 낮은 세포성과 거대 림프종 세포의 취약성으로 인해 제한될 수도 있습니다13,14,15. 세포병리학과 유세포분석 모두 온전한 전체 세포를 필요로 합니다. 이러한 세포의 대부분은 수집, 저장 및 처리 중에 파괴됩니다. 온전한 세포에서 추출한 DNA(세포 DNA)를 사용하여 분자 검사를 수행할 때도 이와 동일한 한계가 있습니다. 또한 이러한 모든 시험에 대해 제한된 유리체 표본을 분할하면 각 시험에 사용할 수 있는 재료의 양이 줄어듭니다.
cell-free DNA(cfDNA)는 온전한 세포를 필요로 하지 않는 또 다른 DNA 공급원입니다. 유리체 표본의 cfDNA는 VRL 16,17 및 포도막 흑색종18의 검출에 사용되었습니다. 이 프로토콜에서는 유리체 및 수성 유체에서 세포 및 cell-free DNA를 추출하여 VRL을 검출합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유리체 망막 림프종(VRL)은 공격적인 거대 B 세포 림프종(large B-cell lymphoma)1,2,3으로, 증상은 다른 유리체 망막 질환과 유사할 수 있다 4,5. 유리체의 분자 검사, 그리고 최근에는 수액의 분자 검사가 VRL의 진단을 내리거나 배제하는 중요한 방법이 되었습니다. 그러나 이러한 유체는 부피…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS 및 Helmut Weigelin, MLS(ASCP)는 우리 실험실에서 이 추출 방법을 확립하는 데 중요한 역할을 했습니다.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
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