Cellfri DNA-extraktion av glaskropps- och kammarvattenprover för diagnos och övervakning av vitreoretinalt lymfom
Summary
En procedur för att extrahera cellfritt DNA från glaskropp och kammarvatten för att utföra molekylära studier för diagnos av vitreoretinalt lymfom etableras här. Metoden ger möjlighet att samtidigt extrahera DNA från den cellulära komponenten i provet eller att reservera det för kompletterande testning.
Abstract
Vitreoretinalt lymfom (VRL) representerar ett aggressivt lymfom, ofta kategoriserat som primärt diffust storcelligt B-cellslymfom i centrala nervsystemet. För att diagnostisera VRL samlas prover som glaskroppshumor och, på senare tid, kammarvatten in. Diagnostisk testning för VRL på dessa prover inkluderar cytologi, flödescytometri och molekylär testning. Men både cytopatologi och flödescytometri, tillsammans med molekylär testning med cellulärt DNA, kräver intakta hela celler. Utmaningen ligger i det faktum att glasaktig och vattenhaltig humor vanligtvis har låg cellularitet, och många celler förstörs under insamling, lagring och bearbetning. Dessutom utgör dessa prover ytterligare svårigheter för molekylär testning på grund av den höga viskositeten hos glaskroppen och den låga volymen av både glaskropp och vatten. Denna studie föreslår en metod för att extrahera cellfritt DNA från glasaktiga och vattenhaltiga prover. Detta tillvägagångssätt kompletterar extraktionen av cellulärt DNA eller gör att den cellulära komponenten i dessa prover kan användas för andra diagnostiska metoder, inklusive cytologi och flödescytometri.
Introduction
Vitreoretinalt lymfom (VRL) är ett aggressivt lymfom associerat med primärt diffust storcelligt B-cellslymfomi centrala nervsystemet 1,2,3. VRL är vanligtvis dödligt på grund av dess engagemang i det centrala nervsystemet 1,2. Även om det är sällsynt1,4 uppvisar VRL ofta symtom som liknar bakre uveit och andra vitreoretinala sjukdomar 4,5. Följaktligen kräver patienter som uppvisar uveitsymtom en diagnos för att antingen bekräfta eller utesluta VRL.
Nyligen publicerades konsensuskriterier för diagnostisering av VRL, som innebär en kombination av klinisk undersökning och laboratoriefynd6. Prover som vanligtvis används för att diagnostisera VRL inkluderar glaskroppshumor och, på senare tid, kammarvatten7. Glaskroppshumor erhålls genom ett kirurgiskt ingrepp som kallas pars plana vitrektomi, vilket ger tillgång till ögats bakre segment8.
I det presenterade protokollet samlades både kammarvatten och glaskroppsprover in för cellulär och cfDNA-extraktion. Efter att ha sövt patienterna och placerat troakarna ca 4 mm från hornhinnans limbus, erhölls ett kammarvattenprov på ca 100-200 μL med hjälp av en 1 ml tuberkulinspruta vid hornhinnans limbus. För pseudofakiska patienter erhölls outspädd glaskropp genom att steril luft tillfördes infusionen, vilket möjliggjorde uppsamling av en större mängd outspädd glaskropp (upp till 3,5 ml). Hos fakiska patienter avlägsnades cirka 500 till 1000 μl outspädd glaskropp innan en infusion av balanserad saltlösning sattes på. I vissa fall samlades sekundärt utspädd glaskropp (500 till 2 000 μL) upp genom att infusionen omvandlades till vätska och vitrektorn placerades i glaskroppen för att få detta prov. Den mest utspädda glaskroppsfraktionen samlades in genom att bevara kassettpåsen (kompletterande figur 1) i slutet av operationen. När denna påse nådde patologiavdelningen erhölls utspädd glaskropp genom att dränera vätska ur denna påse till koniska rör för efterföljande DNA-extraktion.
Cytopatologi av glaskroppsvätska anses ofta vara guldstandarden9. Flera studier har dock visat begränsad känslighet på grund av bearbetning och minimal cellularitet10,11,12. Flödescytometri kan hjälpa till att identifiera klonala B-celler men kan också begränsas av låg cellularitet och bräcklighet hos stora lymfomceller13,14,15. Både cytopatologi och flödescytometri kräver intakta hela celler. Många av dessa celler förstörs under insamling, lagring och bearbetning. När molekylär testning utförs med hjälp av DNA extraherat från intakta celler (cellulärt DNA), lider det av samma begränsning. Att dela upp det begränsade glaskroppen för alla dessa tester minskar dessutom mängden material som är tillgängligt för varje test.
Cellfritt DNA (cfDNA) är en annan DNA-källa som inte kräver intakta celler. cfDNA från glaskroppsprover har använts för detektion av VRL 16,17 samt uvealt melanom18. I detta protokoll extraheras cellulärt och cellfritt DNA från glasaktig och vattenhaltig vätska för att detektera VRL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vitreoretinalt lymfom (VRL) är ett aggressivt storcelligt B-cellslymfom 1,2,3 vars symtom kan efterlikna andra vitreoretinala sjukdomar 4,5. Molekylär testning av glaskropps- och på senare tid kammarvatten har blivit en kritisk metod för att ställa diagnosen VRL eller utesluta det. Dessa vätskor är dock mycket låga i volym och har ofta låg cellularitet. Många a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS och Helmut Weigelin, MLS(ASCP) var avgörande för att etablera denna extraktionsmetod i vårt laboratorium.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
References
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al. Primary intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 59 (5), 503-516 (2014).
- Coupland, S. E., Damato, B. Understanding intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (6), 564-578 (2008).
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A. Neoplastic masquerade syndrome. Survey Ophthalmology. 47, 81-124 (2002).
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P. Diagnostic testing of vitrectomy specimens. American Journal of Ophthalmology. 140 (5), 822-829 (2005).
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
