מיצוי DNA ללא תאים של דגימות הומור זגוגיות ומימיות לאבחון וניטור של לימפומה זגוגית
Summary
כאן נקבע הליך להפקת DNA נטול תאים מהומור זגוגי ומימי לביצוע מחקרים מולקולריים לאבחון לימפומה זגוגית. השיטה מציעה את היכולת לחלץ במקביל DNA מהמרכיב התאי של הדגימה או לשמור אותו לבדיקות נלוות.
Abstract
לימפומה זגוגית (VRL) מייצגת לימפומה אגרסיבית, המסווגת לעתים קרובות כלימפומה ראשונית של מערכת העצבים המרכזית המפזרת תאי B גדולים. כדי לאבחן VRL, דגימות כגון הומור זגוגית, ולאחרונה, הומור מימי נאספים. בדיקות אבחון VRL על דגימות אלה כוללות ציטולוגיה, ציטומטריית זרימה ובדיקות מולקולריות. עם זאת, הן ציטופתולוגיה והן ציטומטריית זרימה, יחד עם בדיקות מולקולריות באמצעות DNA תאי, מחייבות תאים שלמים שלמים. האתגר טמון בעובדה שלהומור זגוגי ומימי יש בדרך כלל תאיות נמוכה, ותאים רבים נהרסים במהלך האיסוף, האחסון והעיבוד. יתר על כן, דגימות אלה מציבות קשיים נוספים לבדיקה מולקולרית בשל הצמיגות הגבוהה של הומור הזגוגית והנפח הנמוך של הומור הזגוגית והמימית כאחד. מחקר זה מציע שיטה לחילוץ דנ”א נטול תאים מדגימות זגוגיות ומימיות. גישה זו משלימה את מיצוי הדנ”א התאי או מאפשרת להשתמש במרכיב התאי של דגימות אלה לשיטות אבחון אחרות, כולל ציטולוגיה וציטומטריית זרימה.
Introduction
לימפומה זגוגית (VRL) היא לימפומה אגרסיבית הקשורה ללימפומה ראשונית של מערכת העצבים המרכזית, מפושטת של תאי B גדולים 1,2,3. VRL הוא בדרך כלל קטלני בשל מעורבותו במערכת העצבים המרכזית 1,2. למרות נדיר1,4, VRL לעתים קרובות מציג סימפטומים דומים uveitis האחורי ומחלות זגוגית אחרות 4,5. כתוצאה מכך, חולים המציגים תסמיני אובאיטיס דורשים אבחנה כדי לאשר או לשלול VRL.
לאחרונה פורסמו קריטריונים מוסכמים לאבחון VRL, הכוללים שילוב של בדיקה קלינית וממצאי מעבדה6. דגימות נפוצות לאבחון VRL כוללות הומור זגוגית, ולאחרונה, הומור מימי7. הומור הזגוגית מתקבל באמצעות הליך כירורגי שנקרא pars plana vitrectomy, המאפשר גישה לחלק האחורי של העין8.
בפרוטוקול המוצג, נאספו דגימות הומור מימי והומור זגוגי לצורך מיצוי תאי ו- cfDNA. לאחר הרדמת החולים והנחת טרוקרים במרחק של כ-4 מ”מ מלימבוס הקרנית, התקבלה דגימת הומור מימית של כ-100-200 מיקרוליטר באמצעות מזרק שחפת 1 מ”ל בלימבוס הקרנית. עבור חולים פסאודופאקים, זגוגית לא מדוללת הושגה על ידי החדרת אוויר סטרילי לעירוי, המאפשר איסוף של כמות גדולה יותר של זגוגית לא מדוללת (עד 3.5 מ”ל). בחולים פאקיים, כ 500 עד 1000 μL של זגוגית לא מדוללת הוסרו לפני הפעלת עירוי של תמיסת מלח מאוזנת. במקרים מסוימים, זגוגית מדוללת משנית (500 עד 2,000 μL) נאספה על ידי החלפת העירוי לנוזל והצבת הוויטרקטור בתוך חצאית הזגוגית כדי לקבל דגימה זו. החלק הזגוגי המדולל ביותר נאסף על ידי שימור תיק הקלטות (איור משלים 1) בסוף הניתוח. ברגע ששקית זו הגיעה למחלקה הפתולוגית, הזגוגית המדוללת התקבלה מניקוז נוזל מתוך שקית זו לצינורות חרוטיים לצורך מיצוי DNA לאחר מכן.
ציטופתולוגיה של נוזל הזגוגית נחשבת לעתים קרובות לתקן הזהב9. עם זאת, מספר מחקרים הדגימו רגישות מוגבלת עקב עיבוד וסלולריות מינימלית10,11,12. ציטומטריית זרימה יכולה לסייע בזיהוי תאי B משובטים, אך יכולה להיות מוגבלת גם על ידי תאים נמוכים ושבריריות של תאי לימפומה גדולים13,14,15. הן ציטופתולוגיה והן ציטומטריית זרימה דורשות תאים שלמים שלמים. רבים מהתאים האלה נהרסים במהלך האיסוף, האחסון והעיבוד. כאשר הבדיקה המולקולרית מבוצעת באמצעות דנ”א המופק מתאים שלמים (דנ”א תאי), הוא סובל מאותה מגבלה. בנוסף, חלוקת דגימת הזגוגית המוגבלת לכל הבדיקות הללו מפחיתה את כמות החומר הזמין לכל בדיקה.
דנ”א נטול תאים (cfDNA) מייצג מקור נוסף של דנ”א שאינו דורש תאים שלמים. cfDNA מדגימות זגוגית שימש לזיהוי VRL 16,17 וכן מלנומה של uveal18. בפרוטוקול זה, דנ”א תאי ונטול תאים מופקים מנוזל זגוגי ומימי כדי לזהות VRL.
Protocol
Representative Results
Discussion
לימפומה זגוגית (VRL) היא לימפומה אגרסיבית של תאי B גדולים 1,2,3 שתסמיניה יכולים לחקות מחלות זגוגיות אחרות 4,5. בדיקה מולקולרית של זגוגית, ולאחרונה גם הומור מימי, הפכה לשיטה קריטית לאבחנה של VRL או לשלילתה. עם זאת, נ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
טימותי דניאלס, MLS(ASCP), MB, QLS, והלמוט וייגלין, MLS (ASCP) סייעו בביסוס שיטת מיצוי זו במעבדה שלנו.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
References
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al. Primary intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 59 (5), 503-516 (2014).
- Coupland, S. E., Damato, B. Understanding intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (6), 564-578 (2008).
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A. Neoplastic masquerade syndrome. Survey Ophthalmology. 47, 81-124 (2002).
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P. Diagnostic testing of vitrectomy specimens. American Journal of Ophthalmology. 140 (5), 822-829 (2005).
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
