Extracción de ADN libre de células de muestras de humor vítreo y acuoso para el diagnóstico y seguimiento del linfoma vitreorretiniano
Summary
Aquí se establece un procedimiento para extraer ADN libre de células del humor vítreo y acuoso para realizar estudios moleculares para el diagnóstico del linfoma vitreorretiniano. El método ofrece la capacidad de extraer simultáneamente ADN del componente celular de la muestra o reservarlo para pruebas auxiliares.
Abstract
El linfoma vitreorretiniano (VRL, por sus siglas en inglés) representa un linfoma agresivo, que a menudo se clasifica como linfoma primario difuso de células B grandes del sistema nervioso central. Para diagnosticar el VRL, se recogen especímenes como el humor vítreo y, más recientemente, el humor acuoso. Las pruebas diagnósticas para VRL en estos especímenes incluyen citología, citometría de flujo y pruebas moleculares. Sin embargo, tanto la citopatología como la citometría de flujo, junto con las pruebas moleculares con ADN celular, requieren células enteras intactas. El desafío radica en el hecho de que el humor vítreo y acuoso suelen tener una baja celularidad, y muchas células se destruyen durante la recolección, el almacenamiento y el procesamiento. Además, estos especímenes plantean dificultades adicionales para las pruebas moleculares debido a la alta viscosidad del humor vítreo y al bajo volumen del humor vítreo y acuoso. Este estudio propone un método para extraer ADN libre de células de muestras vítreas y acuosas. Este enfoque complementa la extracción de ADN celular o permite que el componente celular de estas muestras se utilice para otros métodos de diagnóstico, como la citología y la citometría de flujo.
Introduction
El linfoma vitreorretiniano (VRL) es un linfoma agresivo asociado al linfoma primario de células B grandes difusa del sistema nervioso central 1,2,3. La VRL suele ser mortal debido a su implicación en el sistema nervioso central 1,2. Aunque es poco frecuente1,4, la VRL a menudo se presenta con síntomas similares a la uveítis posterior y otras enfermedades vitreorretinianas 4,5. En consecuencia, los pacientes que presentan síntomas de uveítis requieren un diagnóstico para confirmar o descartar la VRL.
Recientemente, se publicaron los criterios de consenso para el diagnóstico de la VRL, que implican una combinación de examen clínico y hallazgos de laboratorio6. Los especímenes comúnmente utilizados para diagnosticar VRL incluyen el humor vítreo y, más recientemente, el humor acuoso7. El humor vítreo se obtiene a través de un procedimiento quirúrgico llamado vitrectomía pars plana, que permite el acceso al segmento posterior del ojo8.
En el protocolo presentado, se recolectaron muestras de humor acuoso y humor vítreo para la extracción celular y de ADNcf. Después de anestesiar a los pacientes y colocar los trócares a aproximadamente 4 mm del limbo corneal, se obtuvo una muestra acuosa de humor de aproximadamente 100-200 μL utilizando una jeringa de tuberculina de 1 mL en el limbo corneal. Para los pacientes pseudofáquicos, el vítreo sin diluir se obtuvo mediante la introducción de aire estéril en la perfusión, lo que permitió la recolección de una mayor cantidad de vítreo sin diluir (hasta 3,5 ml). En pacientes fáquicos, se extrajeron aproximadamente de 500 a 1000 μL de vítreo sin diluir antes de encender una infusión de solución salina balanceada. En algunos casos, se recolectó vítreo diluido secundariamente (500 a 2.000 μL) cambiando la infusión a líquido y colocando el vitrrector dentro del faldón vítreo para obtener esta muestra. La fracción vítrea más diluida se recolectó preservando la bolsa de casete (Figura suplementaria 1) al final de la cirugía. Una vez que esta bolsa llegó al servicio de anatomía patológica, se obtuvo vítreo diluido a partir del drenaje del líquido de esta bolsa en tubos cónicos para su posterior extracción de ADN.
La citopatología del líquido vítreo a menudo se considera el estándar de oro9. Sin embargo, varios estudios han demostrado una sensibilidad limitada debido al procesamiento y a la mínima celularidad10,11,12. La citometría de flujo puede ayudar a identificar las células B clonales, pero también puede estar limitada por la baja celularidad y la fragilidad de las células grandes de linfoma13,14,15. Tanto la citopatología como la citometría de flujo requieren células enteras intactas. Muchas de estas células se destruyen durante la recolección, el almacenamiento y el procesamiento. Cuando las pruebas moleculares se realizan utilizando ADN extraído de células intactas (ADN celular), sufre de esta misma limitación. Además, la división de la muestra vítrea limitada para todas estas pruebas reduce la cantidad de material disponible para cada prueba.
El ADN libre de células (cfDNA) representa otra fuente de ADN que no requiere células intactas. El cfDNA de muestras vítreas se ha utilizado para la detección de VRL 16,17, así como de melanoma uveal18. En este protocolo, se extrae ADN celular y libre de células del líquido vítreo y acuoso para detectar VRL.
Protocol
Representative Results
Discussion
El linfoma vitreorretiniano (VRL) es un linfoma agresivo de células B grandes 1,2,3 cuyos síntomas pueden parecerse a los de otras enfermedades vitreorretinianas 4,5. Las pruebas moleculares del humor vítreo y, más recientemente, acuoso se han convertido en un método crítico para hacer el diagnóstico de VRL o descartarlo. Sin embargo, estos fluidos son de muy bajo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Timothy Daniels, MLS(ASCP), MB, QLS, y Helmut Weigelin, MLS(ASCP) fueron fundamentales para establecer este método de extracción dentro de nuestro laboratorio.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | Fischer | A415-500 | |
| DNA Clean & Concentrator-10 | Zymo Research | D4011 | |
| DNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | D4003 | |
| Gentra Puregene Cell Lysis Solution | Qiagen | 158906 | |
| Gentra Puregene DNA Hydration Solution | Qiagen | 158916 | |
| Gentra Puregene Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P-4417 | |
| Quick-DNA Urine Kit | Zymo Research | D3061 | Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns |
| Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL) | Thermo Fisher/Invitrogen | 10814010 |
References
- Chan, C. C., et al. Primary vitreoretinal lymphoma: a report from an International Primary Central Nervous System Lymphoma Collaborative Group symposium. Oncologist. 16 (11), 1589-1599 (2011).
- Sagoo, M. S., et al. Primary intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 59 (5), 503-516 (2014).
- Coupland, S. E., Damato, B. Understanding intraocular lymphomas. Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (6), 564-578 (2008).
- Cassoux, N., et al. Ocular and central nervous system lymphoma: clinical features and diagnosis. Ocular Immunology and Inflammation. 8 (4), 243-250 (2000).
- Read, R. W., Zamir, E., Rao, N. A. Neoplastic masquerade syndrome. Survey Ophthalmology. 47, 81-124 (2002).
- Carbonell, D., et al. Consensus recommendations for the diagnosis of vitreoretinal lymphoma. Ocular Immunology and Inflammation. 23 (3), 507-520 (2021).
- Demirci, H., et al. Aqueous humor-derived MYD88 L265P mutation analysis in vitreoretinal lymphoma: a potential less invasive method for diagnosis and treatment response assessment. Ophthalmology Retina. 7 (2), 189-195 (2023).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E. W., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1971).
- Vogel, M. H., Font, R. L., Zimmerman, L. E., Levine, R. A. Reticulum cell sarcoma of the retina and uvea. Report of sex cases and review of the literature. American Journal of Ophthalmology. 66 (2), 205-215 (1968).
- Kimura, K., Usui, Y., Goto, H. Japanese intraocular lymphoma study group. clinical features and diagnostic significance of the intraocular fluid of 217 patients with intraocular lymphoma. Japanese Journal of Ophthalmology. 56 (4), 383-389 (2012).
- Davis, J. L., Miller, D. M., Ruiz, P. Diagnostic testing of vitrectomy specimens. American Journal of Ophthalmology. 140 (5), 822-829 (2005).
- Char, D. H., Ljung, B. M., Miller, T., Phillips, T. Primary intraocular lymphoma (ocular reticulum cell sarcoma) diagnosis and management. Ophthalmology. 95 (5), 625-630 (1988).
- Tanaka, R., et al. More accurate diagnosis of vitreoretinal lymphoma using a combination of diagnostic test results: a prospective observational study. Ocular Immunology and Inflammation. 30 (6), 1354-1360 (2022).
- Missotten, T., et al. Multicolor flow cytometric immunophenotyping is a valuable tool for detection of intraocular lymphoma. Ophthalmology. 120 (5), 991-996 (2013).
- Bertram, H. C., Check, I. J., Milano, M. A. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlation. American Journal of Clinical Pathology. 116 (2), 191-203 (2001).
- Bonzheim, I., et al. The molecular hallmarks of primary and secondary vitreoretinal lymphoma. Blood Advances. 6 (5), 1598-1607 (2022).
- Shi, H., et al. Clinical relevance of the high prevalence of MYD88 L265P mutated vitreoretinal lymphoma identified by droplet digital polymerase chain reaction. Ocular Immunology and Inflammation. 29 (3), 448-455 (2021).
- Bustamante, P., et al. Circulating tumor DNA tracking through driver mutations as a liquid biopsy-based marker for uveal melanoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 40 (1), 196 (2021).
