Een 3D-visualisatietechniek voor botremodellering in een muismodel met hechtingsexpansie
Summary
Dit protocol presenteert een gestandaardiseerd muismodel voor hechtingsexpansie en een 3D-visualisatiemethode om de mechanobiologische veranderingen van de hechting en botremodellering onder trekkrachtbelasting te bestuderen.
Abstract
Craniofaciale hechtingen spelen een cruciale rol die verder gaat dan vezelige gewrichten die craniofaciale botten met elkaar verbinden; Ze dienen ook als de primaire niche voor de groei van calvariale en gezichtsbotten, met mesenchymale stamcellen en osteoprogenitors. Aangezien de meeste craniofaciale botten zich ontwikkelen door intramembraneuze ossificatie, fungeren de marginale regio’s van de hechtingen als initiatiepunten. Vanwege dit belang zijn deze hechtingen intrigerende doelwitten geworden in orthopedische therapieën zoals veerondersteunde uitzetting van het schedelgewelf, snelle maxillaire expansie en maxillaire protractie. Onder orthopedische opsporingskracht worden hechtstamcellen snel geactiveerd en worden ze een dynamische bron voor botremodellering tijdens expansie. Ondanks hun belang blijven de fysiologische veranderingen tijdens botremodelleringsperioden slecht begrepen. Traditionele sectiemethoden, voornamelijk in de sagittale richting, leggen niet de uitgebreide veranderingen vast die zich voordoen gedurende de hele hechting. Deze studie stelde een standaard muismodel vast voor sagittale hechtingsexpansie. Om veranderingen in botremodellering na uitzetting van de hechting volledig te visualiseren, werd de PEGASOS-methode voor het opruimen van weefsel gecombineerd met EdU-kleuring op het hele geheel en dubbele labeling van calciumcheleren. Dit maakte de visualisatie mogelijk van sterk prolifererende cellen en nieuwe botvorming over de gehele calvariale botten na expansie. Dit protocol biedt een gestandaardiseerd muismodel voor hechtingsexpansie en een 3D-visualisatiemethode, die licht werpt op de mechanobiologische veranderingen in hechtingen en botremodellering onder trekkrachtbelasting.
Introduction
Craniofaciale hechtingen zijn vezelige weefsels die craniofaciale botten met elkaar verbinden en een essentiële rol spelen bij de groei en remodellering van craniofaciale botten. De structuur van de hechting lijkt op een rivier en zorgt voor een stroom van celbronnen om de “rivieroever” te voeden en op te bouwen, bekend als de osteogene fronten, die bijdragen aan de vorming van craniofaciale botten via intramembraneuze osteogenese1.
De belangstelling voor craniofaciale hechtingen is gedreven door klinische behoeften om voortijdige sluiting van schedelhechtingen en disfunctie van aangezichtshechtingen te begrijpen, wat kan leiden tot craniofaciale misvormingen en zelfs levensbedreigende aandoeningen bij kinderen. Open hechting wordt routinematig gebruikt bij klinische behandeling, maar follow-up op lange termijn heeft bij sommige patiënten een onvolledig re-ossificatierecidiefaangetoond2. Minimaal invasieve craniotomie met behulp van expansieveren of endoscopische streepcraniectomie kan een veiligere benadering bieden om de potentiële hechting te behouden in plaats van de weefsels weg te gooien3. Evenzo zijn orthopedische therapieën zoals gezichtsmaskers en expansieapparaten op grote schaal gebruikt om sagittale of horizontale maxillaire hypoplasie te behandelen, waarbij sommige onderzoeken de leeftijdsgrens uitbreidden om volwassen patiënten te behandelen via minischroef-geassisteerde palatinale expanders 4,5,6. Bovendien is craniale hechtdraadregeneratie met mesenchymale stamcellen (MSC’s) in combinatie met biologisch afbreekbare materialen een potentiële therapie in de toekomst, die een nieuwe richting biedt voor de behandeling van gerelateerde ziekten. Het functieproces of het regulerende mechanisme van hechtingen blijft echter ongrijpbaar.
Botremodellering bestaat voornamelijk uit een balans tussen botvorming door osteoblasten en botresorptie door osteoclasten, waarbij osteogene differentiatie van stamcellen gestimuleerd door mechanische signalen een belangrijke rol speelt. Na tientallen jaren van onderzoek is gebleken dat craniofaciale hechtingen zeer plastische mesenchymale stamcelniches zijn8. Hechtstamcellen (SuSC’s) zijn een heterogene groep stamcellen, behorend tot mesenchymale stamcellen (MSC’s) of botstamcellen (SSC’s). SuSC’s worden in vivo gelabeld door vier markers, waaronder Gli1, Axin2, Prrx1 en Ctsk. Met name Gli1+ SuSC’s hebben de biologische kenmerken van stamcellen strikt geverifieerd, niet alleen met een hoge expressie van typische MSC-markers, maar ook met een uitstekend osteogeen en chondrogenepotentieel. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat Gli1+ SuSC’s actief bijdragen aan de vorming van nieuw bot onder trekkracht, door ze te identificeren als de bron van hechtstamcellen die afleidingsosteogenese ondersteunt10.
In het verleden werden uitgebreide mechanische eigenschappen van stamcellen in vitro bestudeerd via Flexcell, vierpuntsbuiging, micromagneetlaadsysteem en andere. Hoewel mesenchymale cellen van schedelhechtingen van muizen in vitrozijn geïdentificeerd 11 en mesenchymale stamcellen van menselijke hechtingen onlangs ook zijn geïsoleerd12, blijft de biomechanische respons van hechtcellen onduidelijk in het in vitro systeem. Om het botremodelleringsproces verder te onderzoeken, is een hechtdraadexpansiemodel opgesteld op basis van geïsoleerde calvaria-orgaancultuur, wat de weg vrijmaakt voor het opstellen van een bruikbaar in vivo hechtdraadexpansiemodel 1,13. Konijnen14 en ratten15 zijn de meest gebruikte dieren in fundamenteel onderzoek voor hechtingsexpansie. Muizen hebben echter de voorkeur voor diermodellen voor het onderzoeken van ziekten bij de mens vanwege hun zeer homologe genoom met mensen, talrijke genmodificatielijnen en een sterk reproductief hybridisatievermogen. Bestaande muismodellen van craniale hechtdraadexpansie vertrouwen doorgaans op orthodontische veerdraden van roestvrij staal om trekkracht uit te oefenen op de sagittale hechting16,17. In deze modellen worden twee gaten gemaakt in elke kant van de pariëtale botten om het expansieapparaat te bevestigen, en de draden zijn ingebed onder de huid, wat de celactiveringsmodus kan beïnvloeden.
Wat de visualisatiemethode betreft, wordt de tweedimensionale waarneming van plakjes in de sagittale richting al tientallen jaren algemeen toegepast. Aangezien botremodellering echter een complex driedimensionaal dynamisch proces is, is het verkrijgen van volledige driedimensionale informatie een dringende behoefte geworden. De PEGASOS-weefseltransparantietechniek is ontwikkeld om aan deze eis te voldoen18,19. Het biedt unieke voordelen voor de transparantie van harde en zachte weefsels, waardoor het volledige botremodelleringsproces in een driedimensionale ruimte kan worden gereproduceerd.
Om een dieper en uitgebreider begrip te krijgen van de fysiologische veranderingen in de botremodelleringsperioden, werd een standaard sagittale hechtdraadexpansiemuismodel met een veerinstelling tussen de handgemaakte houders opgesteld10. Met een gestandaardiseerde zure ets- en hechtingsprocedure kon het expansieapparaat stevig aan het schedelbot worden gehecht, waardoor een trekkracht loodrecht op de sagittale hechting werd gegenereerd. Bovendien werd de PEGASOS-weefselreinigingsmethode toegepast na dubbele labeling van het gemineraliseerde bot na expansie om de veranderingen in de botmodellering na uitzetting van de hechting volledig te visualiseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
We pasten een standaard muismodel voor hechtingsexpansie toe om de regelmatige morfologische veranderingen te observeren die elke week optreden gedurende de gehele remodelleringscyclus van een maand10. Dit model is nuttig voor het onderzoeken van calvariale botremodellering en regeneratie door calvariale hechtingen uit te breiden, evenals voor het bestuderen van verschillende hechtcellen in vivo. Om de resultaten van dergelijk onderzoek volledig te presenteren, is driedimensionale visuali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken voor het laboratoriumplatform en de hulp van Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Dit werk werd ondersteund door het Shanghai Pujiang-programma (22PJ1409200); Nationale Stichting voor Natuurwetenschappen van China (nr. 11932012); Postdoctorale Stichting voor Wetenschappelijk Onderzoek van het Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Financiering van een fundamenteel onderzoeksprogramma van het Ninth People’s Hospital, verbonden aan de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYZZ154).
Materials
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
