Eine 3D-Visualisierungstechnik für den Knochenumbau in einem Nahtexpansions-Mausmodell
Summary
Dieses Protokoll stellt ein standardisiertes Nahtexpansions-Mausmodell und eine 3D-Visualisierungsmethode vor, um die mechanobiologischen Veränderungen der Naht und des Knochenumbaus unter Zugkraftbelastung zu untersuchen.
Abstract
kraniofaziale Nähte spielen eine entscheidende Rolle, die nicht nur fibröse Gelenke sind, die kraniofaziale Knochen verbinden. Sie dienen auch als primäre Nische für das Wachstum von Schädel- und Gesichtsknochen und beherbergen mesenchymale Stammzellen und Osteoprogenitoren. Da sich die meisten kraniofazialen Knochen durch intramembranöse Ossifikation entwickeln, fungieren die Randregionen der Nähte als Initiationspunkte. Aufgrund dieser Bedeutung sind diese Nähte zu faszinierenden Zielen in orthopädischen Therapien wie der federunterstützten Schädelgewölbeerweiterung, der schnellen Oberkiefererweiterung und der Oberkieferprotraktion geworden. Unter orthopädischer Rückverfolgungskraft werden die Stammzellen der Naht schnell aktiviert und werden zu einer dynamischen Quelle für den Knochenumbau während der Expansion. Trotz ihrer Bedeutung sind die physiologischen Veränderungen während des Knochenumbaus nach wie vor unzureichend verstanden. Herkömmliche Schnittmethoden, vor allem in sagittaler Richtung, erfassen nicht die umfassenden Veränderungen, die über die gesamte Naht auftreten. In dieser Studie wurde ein Standard-Mausmodell für die sagittale Nahtexpansion etabliert. Um die Veränderungen des Knochenumbaus nach der Nahtexpansion vollständig sichtbar zu machen, wurde die PEGASOS-Methode zur Gewebereinigung mit einer Whole-Mount-EdU-Färbung und einer Calcium-Chelat-Doppelmarkierung kombiniert. Dies ermöglichte die Visualisierung von stark proliferierenden Zellen und die Neubildung von Knochen über den gesamten Schädelknochen nach der Expansion. Dieses Protokoll bietet ein standardisiertes Nahtexpansionsmodell und eine 3D-Visualisierungsmethode, die Aufschluss über die mechanobiologischen Veränderungen in Nähten und den Knochenumbau unter Zugkraftbelastung gibt.
Introduction
kraniofaziale Nähte sind fibröse Gewebe, die kraniofaziale Knochen verbinden und eine wesentliche Rolle beim Wachstum und Umbau kraniofazialer Knochen spielen. Die Struktur der Naht ähnelt einem Fluss und sorgt für einen Fluss von Zellressourcen, um das “Flussufer” zu nähren und aufzubauen, die als osteogene Fronten bekannt sind und über intramembranöse Osteogenese zur Bildung kraniofazialer Knochen beitragen1.
Das Interesse an kraniofazialen Nähten wurde durch die klinische Notwendigkeit vorangetrieben, den vorzeitigen Verschluss von Schädelnähten und die Dysfunktion der Gesichtsnähte zu verstehen, die zu kraniofazialen Deformitäten und sogar lebensbedrohlichen Zuständen bei Kindern führen können. Die offene Nahtektomie wird routinemäßig in der klinischen Behandlung eingesetzt, aber die Langzeitnachsorge hat bei einigen Patienten ein unvollständiges Rezidiv der Reossifikation gezeigt2. Die minimalinvasive Kraniotomie mit Hilfe von Dehnungsfedern oder die endoskopische Streifenkraniektomie kann einen sichereren Ansatz zur Erhaltung der potenziellen Naht bieten, anstatt das Gewebe zu verwerfen3. In ähnlicher Weise wurden orthopädische Therapien wie Gesichtsmasken und Expansionsapparaturen häufig zur Behandlung von sagittaler oder horizontaler Oberkieferhypoplasie eingesetzt, wobei einige Studien die Altersbeschränkung auf die Behandlung erwachsener Patienten mit Minischrauben-assistierten Gaumenexpandern ausweiteten 4,5,6. Darüber hinaus ist die Regeneration von Schädelnähten mit mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in Kombination mit biologisch abbaubaren Materialien eine potenzielle Therapie in der Zukunft, die eine neue Richtung für die Behandlung verwandter Krankheiten bietet7. Der Funktionsprozess oder der Regulationsmechanismus von Nähten bleibt jedoch schwer fassbar.
Der Knochenumbau besteht hauptsächlich aus einem Gleichgewicht zwischen der Knochenbildung durch Osteoblasten und der Knochenresorption durch Osteoklasten, wobei die osteogene Differenzierung von Stammzellen, die durch mechanische Signale stimuliert wird, eine wichtige Rolle spielt. Nach jahrzehntelanger Forschung wurde festgestellt, dass kraniofaziale Nähte hochplastische mesenchymale Stammzellnischen sind8. Nahtstammzellen (SuSCs) sind eine heterogene Gruppe von Stammzellen, die zu mesenchymalen Stammzellen (MSCs) oder Knochenstammzellen (SSCs) gehören. SuSCs werden in vivo durch vier Marker markiert, darunter Gli1, Axin2, Prrx1 und Ctsk. Insbesondere Gli1+ SuSCs haben die biologischen Eigenschaften von Stammzellen streng verifiziert und zeigen nicht nur eine hohe Expression typischer MSC-Marker, sondern auch ein hervorragendes osteogenes und chondrogenes Potenzial9. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass Gli1+ SuSCs aktiv zur Knochenneubildung unter Zugkraft beitragen und sie als Nahtstammzellquelle identifizieren, die die Distraktionsosteogenese unterstützt10.
In der Vergangenheit wurden umfangreiche mechanische Eigenschaften von Stammzellen in vitro mit Flexcell, Vier-Punkt-Biegung, Mikromagnet-Belastungssystem und anderen untersucht. Obwohl in vitro mesenchymale Zellen aus der Schädelnaht von Mäusen identifiziert wurden 11 und auch mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Naht kürzlich isoliert wurden12, bleibt die biomechanische Reaktion von Nahtzellen im In-vitro-System unklar. Um den Knochenumbauprozess weiter zu untersuchen, wurde ein Nahtexpansionsmodell auf der Grundlage isolierter Calvaria-Organkulturen etabliert, das den Weg für die Etablierung eines nützlichen in vivo Nahtexpansionsmodells ebnet 1,13. Kaninchen14 und Ratten15 sind die am häufigsten verwendeten Tiere in der Grundlagenforschung für die Nahterweiterung. Mäuse sind jedoch aufgrund ihres hochgradig homologen Genoms mit dem Menschen, zahlreicher Genmodifikationslinien und ihrer starken reproduktiven Hybridisierungsfähigkeit bevorzugte Tiermodelle für die Erforschung menschlicher Krankheiten. Bestehende Mausmodelle der kranialen Nahterweiterung stützen sich typischerweise auf kieferorthopädische Federdrähte aus Edelstahl, um Zugkraft auf die sagittale Naht auszuüben16,17. Bei diesen Modellen werden zwei Löcher in jede Seite der Scheitelknochen gebohrt, um das Expansionsgerät zu fixieren, und die Drähte sind unter der Haut eingebettet, was den Zellaktivierungsmodus beeinträchtigen kann.
Was die Visualisierungsmethode betrifft, so hat sich die zweidimensionale Betrachtung von Schichten in sagittaler Richtung seit Jahrzehnten durchgesetzt. In Anbetracht der Tatsache, dass der Knochenumbau ein komplexer dreidimensionaler dynamischer Prozess ist, ist es jedoch dringend erforderlich, vollständige dreidimensionale Informationen zu erhalten. Um diese Anforderung zu erfüllen, wurde die PEGASOS-Technik der Gewebetransparenz entwickelt18,19. Es bietet einzigartige Vorteile für die Transparenz von Hart- und Weichgewebe und ermöglicht es, den gesamten Knochenumbauprozess im dreidimensionalen Raum zu reproduzieren.
Um ein tieferes und umfassenderes Verständnis der physiologischen Veränderungen in den Knochenumbauperioden zu erlangen, wurde ein Standard-Sagittal-Nahtexpansions-Mausmodell mit einer Federeinstellung zwischen den handgefertigten Haltern etabliert10. Mit einem standardisierten Säureätz- und Klebeverfahren konnte die Expansionsvorrichtung fest mit dem Schädelknochen verbunden werden, wodurch eine Zugkraft senkrecht zur sagittalen Naht erzeugt wurde. Darüber hinaus wurde die PEGASOS-Methode zur Gewebereinigung nach doppelter Markierung des mineralisierten Knochens nach der Expansion angewendet, um die Veränderungen der Knochenmodellierung nach der Nahtexpansion vollständig sichtbar zu machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir wandten ein Standard-Nahtexpansions-Mausmodell an, um die regelmäßigen morphologischen Veränderungen zu beobachten, die jede Woche während des gesamten einmonatigen Remodellierungszyklus auftreten10. Dieses Modell ist nützlich für die Erforschung des Umbaus und der Regeneration des Schädelknochens durch die Erweiterung von Schädelknochennähten sowie für die Untersuchung verschiedener Nahtzellen in vivo. Um die Ergebnisse dieser Forschung vollständig darstellen zu können, i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die Laborplattform und die Unterstützung des Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Shanghai Pujiang Program (22PJ1409200); Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (Nr. 11932012); Postdoktoranden-Stiftung für wissenschaftliche Forschung des Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Finanzierung des Ninth People’s Hospital, das an die Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYZZ154) angegliedert ist.
Materials
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
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