En 3D-visualiseringsteknik för benremodellering i en suturexpansionsmusmodell

Summary

Detta protokoll presenterar en standardiserad suturexpansionsmusmodell och en 3D-visualiseringsmetod för att studera de mekanobiologiska förändringarna i suturen och benombyggnad under dragkraftsbelastning.

Abstract

Kraniofaciala suturer spelar en avgörande roll utöver att vara fibrösa leder som förbinder kraniofaciala ben; De fungerar också som den primära nischen för kalvariell och ansiktsbentillväxt, och innehåller mesenkymala stamceller och osteoprogenitorer. Eftersom de flesta kraniofaciala ben utvecklas genom intramembranös förbening, fungerar suturernas marginella regioner som initieringspunkter. På grund av denna betydelse har dessa suturer blivit spännande mål i ortopediska terapier som fjäderassisterad kranialvalvsexpansion, snabb maxillär expansion och maxillär protraktion. Under ortopedisk spårningskraft aktiveras suturstamceller snabbt och blir en dynamisk källa för benombyggnad under expansion. Trots deras betydelse är de fysiologiska förändringarna under benombyggnadsperioder fortfarande dåligt förstådda. Traditionella snittningsmetoder, främst i sagittal riktning, fångar inte de omfattande förändringar som sker genom hela suturen. Denna studie etablerade en standardmusmodell för sagittal suturexpansion. För att fullt ut visualisera förändringar i benombyggnad efter suturexpansion kombinerades PEGASOS-vävnadsrensningsmetoden med helmonterad EdU-färgning och dubbelmärkning av kalciumkelatering. Detta möjliggjorde visualisering av celler med hög tillväxt och nybildning av ben över hela kalvarialbenet efter expansion. Detta protokoll erbjuder en standardiserad suturexpansionsmusmodell och en 3D-visualiseringsmetod, som belyser de mekanobiologiska förändringarna i suturer och benombyggnad under dragkraftsbelastning.

Introduction

Kraniofaciala suturer är fibrösa vävnader som förbinder kraniofaciala ben och spelar viktiga roller i tillväxten och ombyggnaden av kraniofaciala ben. Suturens struktur liknar en flod, vilket ger ett flöde av cellresurser för att ge näring och bygga “flodbanken”, känd som de osteogena fronterna, som bidrar till bildandet av kraniofaciala ben via intramembranös osteogenes¹.

Intresset för kraniofaciala suturer har drivits av kliniska behov av att förstå för tidig stängning av kranialsuturer och ansiktssuturdysfunktion, vilket kan leda till kraniofaciala missbildningar och till och med livshotande tillstånd hos barn. Öppen suturektomi används rutinmässigt vid klinisk behandling, men långtidsuppföljning har visat ofullständiga återfall av benbildning hos vissa patienter². Minimalinvasiv kraniotomi med hjälp av expansionsfjädrar eller endoskopisk ranjeektomi kan ge ett säkrare tillvägagångssätt för att bevara den potentiella suturen snarare än att kassera vävnaderna³. På liknande sätt har ortopediska terapier som ansiktsmasker och expansionsapparater använts i stor utsträckning för att behandla sagittal eller horisontell maxillär hypoplasi, med vissa studier som utvidgar åldersgränsen till att behandla vuxna patienter via miniskruvassisterade palatala expanders ^4,5,6. Dessutom är kranial suturregenerering med mesenkymala stamceller (MSC) i kombination med biologiskt nedbrytbara material en potentiell terapi i framtiden, vilket erbjuder en ny riktning för behandling av relaterade sjukdomar⁷. Funktionsprocessen eller regleringsmekanismen för suturer är dock fortfarande svårfångad.

Benremodellering består huvudsakligen av en balans mellan benbildning utförd av osteoblaster och benresorption utförd av osteoklaster, där osteogen differentiering av stamceller stimulerad av mekaniska signaler spelar en viktig roll. Efter årtionden av forskning har det visat sig att kraniofaciala suturer är mycket plastiska mesenkymala stamcellsnischer⁸. Suturstamceller (SuSC) är en heterogen grupp av stamceller som tillhör mesenkymala stamceller (MSC) eller benstamceller (SSC). SuSC märks in vivo med fyra markörer, inklusive Gli1, Axin2, Prrx1 och Ctsk. Gli1⁺ SuSCs, i synnerhet, har strikt verifierat stamcellernas biologiska egenskaper, inte bara genom att uppvisa ett högt uttryck av typiska MSC-markörer utan också genom att uppvisa utmärkt osteogen och kondrogen potential⁹. Tidigare forskning har visat att Gli1⁺ SuSC aktivt bidrar till nybildning av ben under dragkraft, och identifierar dem som suturstamcellskällan som stöder distraktionsosteogenes¹⁰.

Tidigare har omfattande mekaniska egenskaper hos stamceller studerats in vitro via Flexcell, fyrpunktsböjning, mikromagnetladdningssystem och andra. Även om mesenkymala celler från mösskraniella suturer har identifierats in vitro¹¹, och humana suturmesenkymala stamceller också har isolerats nyligen¹², är suturkurcellernas biomekaniska respons fortfarande oklar i in vitro-systemet. För att ytterligare undersöka benremodelleringsprocessen har en suturexpansionsmodell baserad på isolerad calvaria-organkultur etablerats, vilket banar väg för att etablera en användbar in vivo suturexpansionsmodell ^1,13. Kaniner¹⁴ och råttor¹⁵ har varit de mest använda djuren i grundforskning för suturexpansion. Möss är dock föredragna djurmodeller för att utforska mänskliga sjukdomar på grund av deras mycket homologa genom med människor, många genmodifieringslinjer och starka reproduktiva hybridiseringsförmåga. Befintliga musmodeller av kranial suturexpansion förlitar sig vanligtvis på ortodontiska fjädertrådar av rostfritt stål för att applicera dragkraft på den sagittala suturen^16,17. I dessa modeller görs två hål på varje sida av parietalbenen för att fixera expansionsanordningen, och trådarna är inbäddade under huden, vilket kan påverka cellaktiveringsläget.

När det gäller visualiseringsmetoden har den tvådimensionella observationen av skivor i sagittal riktning varit allmänt antagen i årtionden. Men med tanke på att benremodellering är en komplex tredimensionell dynamisk process har det blivit ett akut behov att få fullständig tredimensionell information. PEGASOS-tekniken för vävnadstransparens visade sig uppfylla detta krav^18,19. Det erbjuder unika fördelar för transparensen hos hårda och mjuka vävnader, vilket gör att hela benombyggnadsprocessen kan reproduceras i tredimensionellt utrymme.

För att få en djupare och mer omfattande förståelse för de fysiologiska förändringarna i benombyggnadsperioderna etablerades en standard sagittal suturexpansionsmusmodell med en fjäderinställning mellan de handgjorda hållarna¹⁰. Med en standardiserad syraetsning och bindningsprocedur kan expansionsanordningen bindas ordentligt till kranialbenet, vilket genererar en dragkraft vinkelrätt mot den sagittala suturen. Vidare tillämpades PEGASOS-vävnadsrensningsmetoden efter dubbelmärkning av det mineraliserade benet efter expansion för att fullt ut visualisera benmodelleringsförändringarna efter suturexpansion.

Protocol

Alla experimentella procedurer som beskrivs här har godkänts av Animal Care Committee of Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB). 4 veckor gamla C57BL/6 hanmöss användes i denna studie. Alla instrument som användes steriliserades före ingreppet. 1. Förberedelse av suturexpansionsmodellen Förberedelse av två retentionshållare.Använd 0,014 ” australisk tråd eller tråd av rostfritt stå…

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll har en musmodell för sagittal suturexpansion etablerats (Figur 1-2). För 3D-visualisering av förändringar i benmodellering efter suturexpansion tillämpades PEGASOS-vävnadsrensningsmetoden på hela kalvarbenen efter expansion. Efter perfusion separerades kalvarben (Figur 3A) och den lämpliga PEGASOS-processen fortsatte (Tabell 1 och Tabell 2). Anmärkningsvär…

Discussion

Vi tillämpade en standardmodell av suturexpansionsmus för att observera de regelbundna morfologiska förändringar som sker varje vecka under hela den månadslånga ombyggnadscykeln¹⁰. Denna modell är användbar för att forska om kalvvariell benremodellering och regenerering genom att expandera kalvvariala suturer, samt för att studera olika suturceller in vivo. För att fullt ut presentera resultaten av sådan forskning behövs tredimensionell visualisering av färgade vävnader. D?…

Materials

37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027