Sütür Genişletme Fare Modelinde Kemiğin Yeniden Modellenmesi için 3 Boyutlu Görselleştirme Tekniği
Summary
Bu protokol, gerilme kuvveti yükü altında sütürün mekanobiyolojik değişikliklerini ve kemiğin yeniden şekillenmesini incelemek için standartlaştırılmış bir sütür genişletme fare modeli ve 3 boyutlu bir görselleştirme yöntemi sunar.
Abstract
Kraniyofasiyal sütürler, kraniyofasiyal kemikleri birbirine bağlayan fibröz eklemler olmanın ötesinde çok önemli bir rol oynar; Ayrıca, mezenkimal kök hücreleri ve osteoprogenitörleri barındıran kalvarial ve fasiyal kemik büyümesi için birincil niş görevi görürler. Kraniyofasiyal kemiklerin çoğu intramembranöz kemikleşme yoluyla geliştiğinden, sütürlerin marjinal bölgeleri başlangıç noktaları olarak işlev görür. Bu önemi nedeniyle, bu sütürler yay destekli kraniyal tonoz genişletme, hızlı üst çene genişletme ve üst çene protraksiyonu gibi ortopedik tedavilerde ilgi çekici hedefler haline gelmiştir. Ortopedik izleme kuvveti altında, sütür kök hücreleri hızla aktive edilir ve genişleme sırasında kemiğin yeniden şekillenmesi için dinamik bir kaynak haline gelir. Önemlerine rağmen, kemiğin yeniden şekillenme dönemlerindeki fizyolojik değişiklikler tam olarak anlaşılamamıştır. Başta sagital yönde olmak üzere geleneksel kesit alma yöntemleri, tüm sütür boyunca meydana gelen kapsamlı değişiklikleri yakalamaz. Bu çalışmada sagital sütür genişletme için standart bir fare modeli oluşturulmuştur. Sütür genişletme sonrası kemik yeniden şekillenme değişikliklerini tam olarak görselleştirmek için, PEGASOS doku temizleme yöntemi, tam montajlı EdU boyama ve kalsiyum şelatlama çift etiketleme ile birleştirildi. Bu, genişlemeyi takiben tüm kalvarial kemikler boyunca yüksek oranda çoğalan hücrelerin ve yeni kemik oluşumunun görselleştirilmesine izin verdi. Bu protokol, standartlaştırılmış bir sütür genişletme fare modeli ve 3 boyutlu bir görselleştirme yöntemi sunarak, sütürlerdeki mekanobiyolojik değişikliklere ve gerilme kuvveti yükü altında kemiğin yeniden şekillenmesine ışık tutar.
Introduction
Kraniyofasiyal sütürler, kraniyofasiyal kemikleri birbirine bağlayan ve kraniyofasiyal kemiklerin büyümesinde ve yeniden şekillenmesinde önemli rol oynayan fibröz dokulardır. Sütürün yapısı bir nehri andırır ve intramembranöz osteogenez yoluyla kraniyofasiyal kemiklerin oluşumuna katkıda bulunan osteojenik cepheler olarak bilinen “nehir kıyısını” beslemek ve inşa etmek için bir hücre kaynağı akışı sağlar1.
Kraniyofasiyal sütürlere olan ilgi, çocuklarda kraniyofasiyal deformitelere ve hatta hayatı tehdit eden durumlara yol açabilen kraniyal sütürlerin ve fasiyal sütür disfonksiyonunun erken kapanmasını anlamaya yönelik klinik ihtiyaçlardan kaynaklanmaktadır. Açık süturektomi klinik tedavide rutin olarak kullanılmaktadır, ancak uzun süreli takiplerde bazı hastalarda eksik re-ossifikasyon nüksü gösterilmiştir2. Genleşme yayları veya endoskopik şerit kraniektomi ile desteklenen minimal invaziv kraniotomi, dokuları atmak yerine potansiyel sütürü korumak için daha güvenli bir yaklaşım sağlayabilir3. Benzer şekilde, yüz maskeleri ve genişletme cihazları gibi ortopedik tedaviler, sagital veya yatay maksiller hipoplaziyi tedavi etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bazı çalışmalar, minivida destekli damak genişleticiler aracılığıyla yetişkin hastaları tedavi etmek için yaş sınırlamasını genişletmektedir 4,5,6. Ek olarak, biyolojik olarak parçalanabilen materyallerle birleştirilmiş mezenkimal kök hücreler (MSC’ler) ile kraniyal sütür rejenerasyonu, ilgili hastalıkların tedavisi için yeni bir yön sunan, gelecekte potansiyel bir tedavidir7. Bununla birlikte, sütürlerin işlev süreci veya düzenleyici mekanizması belirsizliğini korumaktadır.
Kemiğin yeniden şekillenmesi esas olarak, osteoblastlar tarafından yürütülen kemik oluşumu ile mekanik sinyallerle uyarılan kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasının önemli bir rol oynadığı osteoklastlar tarafından yürütülen kemik rezorpsiyonu arasındaki dengeden oluşur. Onlarca yıl süren araştırmalardan sonra, kraniyofasiyal sütürlerin oldukça plastik mezenkimal kök hücre nişleri olduğu bulunmuştur8. Sütür kök hücreleri (SuSC’ler), mezenkimal kök hücrelere (MSC’ler) veya kemik kök hücrelerine (SSC’ler) ait heterojen bir kök hücre grubudur. SuSC’ler, Gli1, Axin2, Prrx1 ve Ctsk dahil olmak üzere dört belirteç ile in vivo olarak etiketlenir. Özellikle Gli1+ SuSC’ler, kök hücrelerin biyolojik özelliklerini kesin olarak doğrulamıştır, sadece tipik MSC belirteçlerinin yüksek ekspresyonunu sergilemekle kalmaz, aynı zamanda mükemmel osteojenik ve kondrojenik potansiyelgösterir 9. Önceki araştırmalar, Gli1+ SuSC’lerin gerilme kuvveti altında yeni kemik oluşumuna aktif olarak katkıda bulunduğunu ve bunları distraksiyon osteogenezini destekleyen sütür kök hücre kaynağı olarak tanımladığını göstermiştir10.
Geçmişte, kök hücrelerin kapsamlı mekanik özellikleri Flexcell, dört noktalı bükme, mikro mıknatıs yükleme sistemi ve diğerleri aracılığıyla in vitro olarak incelenmiştir. Fare kraniyal sütür kaynaklı mezenkimal hücreler in vitro11 olarak tanımlanmış ve insan sütür mezenkimal kök hücreleri de yakın zamanda izole edilmişolsa da 12, in vitro sistemde sütür hücrelerinin biyomekanik yanıtı belirsizliğini korumaktadır. Kemiğin yeniden şekillenme sürecini daha fazla araştırmak için, izole kalvaria organ kültürüne dayalı bir sütür genişletme modeli oluşturulmuştur ve bu da yararlı bir in vivo sütür genişletme modeli oluşturmanın yolunu açmıştır 1,13. Tavşan14 ve sıçan15, sütür genişletme için temel araştırmalarda en yaygın kullanılan hayvanlar olmuştur. Bununla birlikte, fareler, insanlarla oldukça homolog genomları, çok sayıda gen modifikasyon hattı ve güçlü üreme hibridizasyon yetenekleri nedeniyle insan hastalıklarını araştırmak için tercih edilen hayvan modelleridir. Kraniyal sütür genişlemesinin mevcut fare modelleri, sagital sütüre gerilme kuvveti uygulamak için tipik olarak paslanmaz çelik ortodontik yay tellerine dayanır16,17. Bu modellerde, genişleme cihazını sabitlemek için parietal kemiklerin her iki tarafında iki delik açılır ve teller cildin altına gömülür, bu da hücre aktivasyon modunu etkileyebilir.
Görselleştirme yöntemi ile ilgili olarak, dilimlerin sagital yönde iki boyutlu gözlemi genellikle onlarca yıldır benimsenmiştir. Bununla birlikte, kemiğin yeniden şekillenmesinin karmaşık üç boyutlu dinamik bir süreç olduğu göz önüne alındığında, eksiksiz üç boyutlu bilgi elde etmek acil bir ihtiyaç haline gelmiştir. Bu gereksinimi karşılamak için PEGASOS doku saydamlık tekniği ortaya çıkmıştır18,19. Sert ve yumuşak dokuların şeffaflığı için benzersiz avantajlar sunarak, tüm kemik yeniden şekillenme sürecinin üç boyutlu uzayda yeniden üretilmesini sağlar.
Kemiğin yeniden şekillenme dönemlerindeki fizyolojik değişiklikler hakkında daha derin ve daha kapsamlı bir anlayış elde etmek için, el yapımı tutucular arasında yay ayarlı standart bir sagital sütür genişletme faresi modeli oluşturulmuştur10. Standartlaştırılmış bir asitle aşındırma ve yapıştırma prosedürü ile, genişletme cihazı kraniyal kemiğe sıkıca bağlanabilir ve sagital sütüre dik bir gerilme kuvveti oluşturabilir. Ayrıca, sütür genişletme sonrası kemik modelleme değişikliklerini tam olarak görselleştirmek için ekspansiyon sonrası mineralize kemiğin çift etiketlenmesinden sonra PEGASOS doku temizleme yöntemi uygulandı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir ay süren yeniden modelleme döngüsü10 boyunca her hafta meydana gelen düzenli morfolojik değişiklikleri gözlemlemek için standart bir sütür genişletme faresi modeli uyguladık. Bu model, kalvarial sütürleri genişleterek kalvarial kemik yeniden şekillenmesi ve rejenerasyonunu araştırmak ve ayrıca çeşitli sütür hücrelerini in vivo incelemek için kullanışlıdır. Bu tür araştırmaların sonuçlarını tam olarak sunmak için, boyanmış dokuların üç boyutlu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Şanghay Jiaotong Üniversitesi Tıp Fakültesi, Kulak Enstitüsü’nün laboratuvar platformu ve yardımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Şanghay Pujiang Programı (22PJ1409200) tarafından desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No.11932012); Şanghay Dokuzuncu Halk Hastanesi Doktora Sonrası Bilimsel Araştırma Vakfı, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi; Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi’ne (JYZZ154) bağlı Dokuzuncu Halk Hastanesi’nin temel araştırma programı finansmanı.
Materials
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
