Modélisation précoce non guidée de la niche neurovasculaire organoïde du cerveau humain dans la membrane chorioallantoïde permissive de l’embryon de poussin
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour greffer des organoïdes cérébraux humains à plusieurs stades de maturation dans la membrane chorioallantoïdienne (CAM) du poulet. Les organoïdes cérébraux ont été cultivés selon des protocoles standardisés non guidés.
Abstract
La greffe d’organoïdes dans des tissus vascularisés chez des animaux modèles, tels que la membrane chorioallantoïde (CAM) immunodéficiente de souris ou d’embryon de poussin, s’est avérée efficace pour la modélisation de la néovascularisation. La CAM est une membrane extraembryonnaire richement vascularisée, qui présente une immunoréactivité limitée, devenant ainsi un excellent modèle d’accueil pour les greffes de cellules d’origine humaine.
Cet article décrit la stratégie pour greffer des organoïdes cérébraux humains différenciés à plusieurs stades de maturation dans la CAM. La composition cellulaire des organoïdes cérébraux change avec le temps, reflétant les étapes importantes du développement du cerveau humain. Nous avons greffé des organoïdes cérébraux aux stades de maturation pertinents : expansion neuroépithéliale (18 DIV), neurogenèse précoce (60 DIV) et gliogenèse précoce (180 DIV) dans la CAM d’embryons embryonnaires de poulet jour (E)7. Des organoïdes cérébraux greffés ont été prélevés 5 jours plus tard et leurs caractéristiques histologiques ont été analysées.
Aucun signe histologique de néovascularisation dans les organoïdes greffés ou vaisseaux sanguins anormaux adjacents aux greffes n’a été détecté. De plus, des changements remarquables ont été observés dans la composition cellulaire des organoïdes greffés, à savoir une augmentation du nombre d’astrocytes réactifs à l’acide fibrillaire glial. Cependant, les changements cytoarchitecturaux dépendaient du stade de maturation des organoïdes. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que les organoïdes cérébraux peuvent se développer dans la CAM, et ils montrent des différences dans la cytoarchitecture en fonction de leur stade de maturation à la greffe.
Introduction
Les organoïdes cérébraux humains sont une technique émergente qui nous permet de récapituler le développement précoce du cerveau humain in vitro 1,2,3. Néanmoins, l’une des limites majeures de ce modèle est le manque de vascularisation, qui joue un rôle indispensable non seulement dans l’homéostasie cérébrale mais aussi dans le développement du cerveau4. En plus de l’apport d’oxygène et de nutriments, de plus en plus de preuves suggèrent que le système vasculaire du cerveau régule la différenciation, la migration et la synaptogenèse neuronales au cours du développement 5,6. Par conséquent, il est urgent d’établir des modèles fiables capables de fournir la signalisation vasculaire et la structure manquantes aux organoïdes cérébraux, augmentant ainsi la complexité de la génération d’organoïdes cérébraux humains7.
Parmi les méthodes de vascularisation proposées, deux axes principaux peuvent être envisagés : la greffe d’organoïdes dans un organisme vivant et les technologies purement in vitro co-cultivant des cellules endothéliales et des cellules neurales 8,9,10,11,12. La transplantation intracérébrale chez la souris est coûteuse et prend du temps, ce qui rend d’autres technologies pertinentes pour des modèles plus simples. Le test de la membrane chorioallantoïdienne (CAM) du poulet a été largement utilisé pour étudier l’angiogenèse 13,14,15. Au cours de la dernière décennie, plusieurs groupes ont réussi à greffer différents types d’organoïdes, notamment des organoïdes rénaux16,17, cardiaques18 et tumoraux19,20, dans des CAM. Néanmoins, on sait peu de choses sur l’efficacité, la toxicité/rejet, l’effet physiologique et les méthodes de greffe d’organoïdes cérébraux humains dans la MCA. Un autre aspect intéressant et encore inexploré est la formation d’une barrière hémato-encéphalique chimérique (BHE) entre la CAM et l’interface astrocytaire organoïde. Des travaux pionniers antérieurs ont suggéré la faisabilité présumée de générer une BHE dans le CAM en transplantant des astrocytes et un milieu conditionné par les astrocytes 21,22,23. Cependant, les astrocytes matures semblent incapables d’atteindre ce24,25. Ainsi, la formation de la BHE induite par les astrocytes reste discutable, et la transplantation d’organoïdes cérébraux humains permettrait de faire la lumière sur cette controverse.
Cet article vidéo décrit un protocole de greffe d’organoïdes cérébraux humains in ovo dans la MCA qui favorise la croissance, l’amélioration et la vascularisation, ce qui permet d’obtenir des organoïdes qui englobent des éléments de la BHE histologiquement compatibles. Ici, nous présentons un protocole assurant la survie de l’embryon de poulet et rapportons la permissivité de la CAM pour soutenir la croissance des organoïdes cérébraux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous décrivons un protocole détaillé avec de nombreuses étapes clés qui assurent une croissance et un développement favorables des organoïdes cérébraux humains lors de la greffe sans perturber la survie des embryons de poulet. Nous avons recommandé l’utilisation d’aiguilles stériles pour percer la chambre à air de l’œuf après 24 h d’incubation (jour 1). De plus, nous avons également essayé de faire la ponction au jour 4 (après avoir vérifié la coquille de l’œuf à la lumi?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Alcántara et le Dr Ortega de l’UB et le reste des membres du laboratoire du Dr Acosta pour ces discussions perspicaces. S.A. est professeur adjoint à la Generalitat de Catalunya de l’Université de Barcelone.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
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