Modellazione precoce della nicchia neurovascolare dell'organoide umano non guidato nella membrana corioallantoica dell'embrione permissivo del pulcino
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per innestare organoidi cerebrali umani in più stadi di maturazione nella membrana corioallantoica (CAM) del pulcino. Gli organoidi cerebrali sono stati coltivati seguendo protocolli standardizzati non guidati.
Abstract
L’innesto di organoidi in tessuti vascolarizzati in animali modello, come la membrana corioallantoica (CAM) immunodeficiente di topo o di embrione di pulcino, si è dimostrata efficace per la modellizzazione della neovascolarizzazione. La CAM è una membrana extraembrionale riccamente vascolarizzata, che mostra una limitata immunoreattività, diventando così un eccellente modello di hosting per trapianti di cellule di origine umana.
Questo articolo descrive la strategia per innestare organoidi cerebrali umani differenziati a più stadi di maturazione nella CAM. La composizione cellulare degli organoidi cerebrali cambia nel tempo, riflettendo le pietre miliari dello sviluppo del cervello umano. Abbiamo innestato organoidi cerebrali nelle fasi di maturazione rilevanti: espansione neuroepiteliale (18 DIV), neurogenesi precoce (60 DIV) e gliogenesi precoce (180 DIV) nella CAM di embrioni di pollo del giorno embrionale (E)7. Gli organoidi cerebrali trapiantati sono stati raccolti 5 giorni dopo e le loro caratteristiche istologiche sono state analizzate.
Non sono stati rilevati segni istologici di neovascolarizzazione negli organoidi innestati o vasi sanguigni anomali adiacenti agli innesti. Inoltre, sono stati osservati notevoli cambiamenti nella composizione cellulare degli organoidi innestati, vale a dire, un aumento del numero di astrociti gliali fibrillari acidi positivi-reattivi. Tuttavia, i cambiamenti citoarchitettonici dipendevano dallo stadio di maturazione dell’organoide. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che gli organoidi cerebrali possono crescere nella CAM e mostrano differenze nella citoarchitettura a seconda del loro stadio di maturazione all’innesto.
Introduction
Gli organoidi cerebrali umani sono una tecnica emergente che ci permette di ricapitolare lo sviluppo precoce del cervello umano in vitro 1,2,3. Tuttavia, uno dei principali limiti di questo modello è la mancanza di vascolarizzazione, che svolge ruoli indispensabili non solo nell’omeostasi cerebrale ma anche nello sviluppo cerebrale4. Oltre alla fornitura di ossigeno e sostanze nutritive, l’accumulo di prove suggerisce che il sistema vascolare del cervello regola la differenziazione neurale, la migrazione e la sinaptogenesi durante lo sviluppo 5,6. Pertanto, c’è un urgente bisogno di stabilire modelli affidabili in grado di fornire la segnalazione vascolare mancante e la struttura agli organoidi cerebrali, migliorando la complessità della generazione di organoidi cerebrali umani7.
Tra i metodi proposti per la vascolarizzazione, si possono considerare due linee principali: l’innesto di organoidi in un organismo vivente e le tecnologie puramente in vitro che co-coltivano cellule endoteliali e cellule neurali 8,9,10,11,12. Il trapianto intracerebrale nei topi è costoso e richiede molto tempo, il che rende altre tecnologie rilevanti per modelli più semplici. Il test della membrana corioallantoica del pulcino (CAM) è stato ampiamente utilizzato per studiare l’angiogenesi 13,14,15. Nell’ultimo decennio, diversi gruppi hanno innestato con successo diversi tipi di organoidi, tra cui il rene16,17, il cuore18 e gli organoidi tumorali19,20, in CAM. Tuttavia, poco si sa sull’efficacia, la tossicità/rigetto, l’effetto fisiologico e i metodi per innestare organoidi cerebrali umani nella CAM. Un altro aspetto interessante e ancora inesplorato è la formazione di una barriera emato-encefalica chimerica (BBB) tra la CAM e l’interfaccia astrocitaria organoide. Precedenti lavori pionieristici hanno suggerito la fattibilità putativa della generazione di una BBB nella CAM mediante trapianto di astrociti e terreno condizionato da astrociti 21,22,23. Tuttavia, gli astrociti maturi sembrano non essere in grado di raggiungere questo24,25. Pertanto, la formazione indotta dagli astrociti della BBB rimane discutibile e il trapianto di organoidi cerebrali umani ci permetterebbe di far luce su questa controversia.
Questo articolo video descrive un protocollo per un trapianto di organoidi cerebrali umani in OVO in CAM che promuove la crescita, il miglioramento e la vascolarizzazione, ottenendo organoidi che comprendono elementi BBB istologicamente compatibili. Qui, presentiamo un protocollo che garantisce la sopravvivenza dell’embrione di pollo e riportiamo la permissività della CAM per sostenere la crescita degli organoidi cerebrali.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, descriviamo un protocollo dettagliato con numerosi passaggi chiave che forniscono una crescita e uno sviluppo favorevoli degli organoidi cerebrali umani dopo l’innesto senza perturbare la sopravvivenza degli embrioni di pollo. Si consiglia l’uso di aghi sterili per perforare la camera d’aria dell’uovo dopo 24 ore di incubazione (giorno 1). Inoltre, abbiamo anche provato a fare la puntura al giorno 4 (dopo aver controllato attraverso il guscio d’uovo con la luce per testare lo sviluppo della vascolarizza…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Alcántara e il Dott. Ortega dell’UB e il resto dei membri del laboratorio del Dott. Acosta per le approfondite discussioni. S.A. è professore assistente presso la Generalitat de Catalunya dell’Universitat de Barcelona.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
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