Her presenterer vi en protokoll for å innpode menneskelige hjerneorganoider ved flere modningsstadier i kyllingens chorioallantoiske membran (CAM). Hjerneorganoider ble dyrket etter ikke-styrte standardiserte protokoller.
Engrafting av organoider i vaskularisert vev i modelldyr, som immundefekt mus eller kyllingembryo chorioallantoic membran (CAM), har vist seg å være effektiv for neovaskulariseringsmodellering. CAM er en rikt vaskularisert ekstraembryonal membran, som viser begrenset immunoreaktivitet, og dermed blir en utmerket vertsmodell for celletransplantasjoner av menneskelig opprinnelse.
Dette papiret beskriver strategien for å pode menneskelige hjerneorganoider differensiert på flere modningsstadier inn i CAM. Den cellulære sammensetningen av hjerneorganoider endres med tiden, noe som gjenspeiler milepælene i menneskelig hjerneutvikling. Vi podet hjerneorganoider i relevante modningsstadier: nevroepitelial ekspansjon (18 DIV), tidlig nevrogenese (60 DIV) og tidlig gliogenese (180 DIV) inn i alternativ behandling hos embryonale dag (E)7 kyllingembryoer. Engrafted hjerneorganoider ble høstet 5 dager senere og deres histologiske egenskaper ble analysert.
Det ble ikke påvist histologiske tegn til neovaskularisering i de transplanterte organoidene eller unormale blodkar ved siden av transplantatene. Videre ble det observert bemerkelsesverdige endringer i den cellulære sammensetningen av de podede organoider, nemlig en økning i antall glialfibrillære sure protein-positive-reaktive astrocytter. De cytoarkitektoniske forandringene var imidlertid avhengig av organoidmodningsstadiet. Samlet sett antyder disse resultatene at hjerneorganoider kan vokse i CAM, og de viser forskjeller i cytoarkitekturen avhengig av modningsstadiet ved poding.
Menneskelige hjerneorganoider er en fremvoksende teknikk som gjør at vi kan rekapitulere den tidlige utviklingen av den menneskelige hjerne in vitro 1,2,3. Likevel er en av de største begrensningene i denne modellen mangelen på vaskularisering, som spiller uunnværlige roller, ikke bare i hjernens homeostase, men også i hjernens utvikling4. I tillegg til levering av oksygen og næringsstoffer, tyder akkumulerende bevis på at hjernens vaskulære system regulerer nevral differensiering, migrasjon og synaptogenese under utvikling 5,6. Derfor er det et presserende behov for å etablere pålitelige modeller som kan gi den manglende vaskulære signaleringen og strukturen til hjerneorganoider, og øke kompleksiteten til menneskelig hjerneorganoid generasjon7.
Blant de foreslåtte metodene for vaskularisering kan to hovedstrømlinjer vurderes: organoid engrafting i en levende organisme og rent in vitro-teknologier som dyrker endotelceller og nevrale celler 8,9,10,11,12. Intracerebral transplantasjon hos mus er kostbart og tidkrevende, noe som gjør andre teknologier relevante for enklere modeller. Chick chorioallantoic membran (CAM) analysen har blitt brukt mye for å studere angiogenese 13,14,15. I det siste tiåret har flere grupper vellykket enpodet forskjellige typer organoider, inkludert nyre16,17, hjerte18 og tumororganoider19,20, i CAM. Likevel er lite kjent om effekt, toksisitet / avvisning, fysiologisk effekt og metoder for å innpode menneskelige hjerneorganoider i CAM. Et annet interessant og ennå uutforsket aspekt er dannelsen av en kimær blod-hjernebarriere (BBB) mellom CAM og det organoide astrocytiske grensesnittet. Tidligere banebrytende arbeid antydet den antatte muligheten for å generere en BBB i CAM ved å transplantere astrocytter og astrocyttbetinget medium 21,22,23. Imidlertid ser modne astrocytter ut til å være ute av stand til å oppnå dette24,25. Dermed forblir den astrocytinduserte dannelsen av BBB diskutabel, og transplantasjon av menneskelige hjerneorganoider vil tillate oss å kaste lys over denne kontroversen.
Denne videoartikkelen beskriver en protokoll for en in ovo human hjerneorganoid transplantasjon i CAM som fremmer vekst, forbedring og vaskularisering, noe som resulterer i organoider som omfatter histologisk kompatible BBB-elementer. Her presenterer vi en protokoll som sikrer overlevelse av kyllingembryoet og rapporterer om tillatelsen til CAM for å opprettholde hjerneorganoid vekst.
I denne studien beskriver vi en detaljert protokoll med mange viktige trinn som gir gunstig vekst og utvikling av menneskelige hjerneorganoider ved poding uten å forstyrre overlevelsen av kyllingembryoene. Vi anbefalte bruk av sterile nåler for å punktere eggets luftkammer etter 24 timers inkubasjon (dag 1). I tillegg prøvde vi også å gjøre punkteringen på dag 4 (etter å ha sjekket gjennom eggeskallet med lys for å teste utviklingen av vaskulaturen for å være sikker på at vi bare jobbet med friske embryoer)….
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Alcántara og Dr. Ortega fra UB og resten av medlemmene i Dr. Acostas laboratorium for innsiktsfulle diskusjoner. SA er Serra-Hunter stipendiat assisterende professor fra Generalitat de Catalunya ved Universitat de Barcelona.
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |