Реалистичное моделирование мембран с использованием сложных липидных смесей в имитационных исследованиях

Summary

Липидное разнообразие мембран по структуре и составу является важным фактором, влияющим на клеточные процессы, и может быть маркером заболевания. Молекулярно-динамическое моделирование позволяет изучать мембраны и их взаимодействие с биомолекулами с атомистическим разрешением. Здесь мы предоставляем протокол для создания, запуска и анализа сложных мембранных систем.

Abstract

Липиды являются структурными строительными блоками клеточных мембран; Виды липидов различаются в разных клеточных органеллах и в разных организмах. Это разнообразие приводит к различным механическим и структурным свойствам мембраны, которые непосредственно влияют на молекулы и процессы, происходящие на этой границе. Липидный состав динамичен и может служить для модуляции клеточных сигнальных процессов. Вычислительные подходы все чаще используются для прогнозирования взаимодействий между биомолекулами и получения молекулярной информации для экспериментальных наблюдений. Молекулярная динамика (МД) — это метод, основанный на статистической механике, который предсказывает движение атомов на основе сил, которые на них действуют. МД-моделирование может быть использовано для характеристики взаимодействия биомолекул. Здесь мы кратко представим технику, опишем практические шаги для начинающих, заинтересованных в моделировании липидных бислоев, продемонстрируем протокол с помощью программного обеспечения, удобного для начинающих, и обсудим альтернативы, проблемы и важные соображения процесса. В частности, мы подчеркиваем актуальность использования сложных липидных смесей для моделирования интересующей клеточной мембраны для захвата соответствующих гидрофобных и механических сред при моделировании. Мы также обсудим некоторые примеры, когда состав и свойства мембраны модулируют взаимодействие бислоев с другими биомолекулами.

Introduction

Липиды являются основными компонентами мембран, которые обеспечивают границы для клеток и обеспечивают внутриклеточную компартментализацию ^1,2,3. Липиды амфифильные, с полярной головной группой и двумя гидрофобными хвостами жирных кислот; Они самоорганизуются в бислой, чтобы свести к минимуму контакт гидрофобных цепей с водой ^3,4. Различные комбинации гидрофильных головных групп и гидрофобных хвостов приводят к образованию различных классов липидов в биологических мембранах, таких как глицерофосфолипиды, сфинголипиды и стерины (рис. 1)^1,5,6. Глицерофосфолипиды являются первичными строительными блоками мембран эукариотических клеток, состоящих из глицерофосфата, длинноцепочечных жирных кислот и головных групп с низкой молекулярной массой⁷. Липидная номенклатура основана на различиях в головных группах; Например, фосфатидилхолин (ФК), фосфатидилэтаноламин (ПЭ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилглицерин (ПГ), фосфатидил-инозитол (ПИ) или немодифицированная фосфатидная кислота (ПА)^5,6. Что касается гидрофобных хвостов, то длина и степень насыщения варьируются, как и структура позвоночника. Возможные комбинации многочисленны, в результате чего в клетках млекопитающих образуются тысячи видов липидов⁶. Изменения липидного состава мембран приводят к различным механическим и структурным свойствам мембраны, которые влияют на активность как интегральных мембранных белков, так и периферических белков ^2,6.

Рисунок 1. Репрезентативные липидные структуры. Хвосты жирных кислот показаны синими прямоугольниками, общие липидные группы головок — оранжевым, а костяк образцов — фиолетовым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Липиды являются активными игроками в клеточных процессах, активации белков в сигнальных каскадах и здоровом клеточном гомеостазе ^8,9. Измененная липидная динамика является следствием инфекции или может быть маркерами патогенеза заболевания 10,11,12,13,14,15. Изучение мембранных липидов и их роли в проникновении малых молекул в качестве барьеров для клетки имеет значение для систем доставки лекарств и механизмов разрушения мембран^16,17. Химическое разнообразие и различное соотношение видов липидов в органеллах, тканях и организмах приводят к сложной мембранной динамике^. Поэтому важно сохранить эти характеристики при моделировании липидных бислоев, особенно когда целью исследования является изучение взаимодействия других биомолекул с мембраной. Виды липидов, которые следует учитывать в модели, зависят от организма и интересующего клеточного компартмента. Например, PG-липиды важны для переноса электронов в фотосинтетических bateria¹⁸, в то время как фосфорилированные инозитоловые липиды (PIPs) играют важную роль в динамике плазматической мембраны (PM) и сигнальных каскадах в клетках млекопитающих ^19,20. Внутри клетки PM, эндоплазматический ретикулум (ER), мембраны Гольджи и митохондрии содержат уникальное количество липидов, которые влияют на их функцию. Например, ER является центром липидного биогенеза и транспортирует холестерин к PM и Гольджи; он содержит высокое липидное разнообразие с обилием ПК и ПЭ, но низкое содержание стеринов, что способствует текучести мембран^21,22,23,24. Напротив, PM включает в себя сотни и даже тысячи видов липидов в зависимости от организма²⁵, он содержит высокие уровни сфинголипидов и холестерина, которые придают ему характерную жесткость по сравнению с другими мембранами в клетке²⁴. Асимметрию створок следует учитывать для мембран, таких как ПМ, которая имеет внешнюю створку, богатую сфингомиелином, ПК и холестерином, и внутреннюю створку, богатую ПЭ, ПИ и ФС, которые важны для сигнальных каскадов²⁴. Наконец, липидное разнообразие также приводит к образованию микродоменов, различающихся по упаковке и внутреннему порядку, известных как липидные рафты^24,26; Они демонстрируют латеральную асимметрию, предположительно играют важную роль в клеточной^{сигнализации,} и их трудно изучать из-за их переходной природы.

Экспериментальные методы, такие как рентгеноскопия, спектроскопия и модельные мембранные системы, такие как гигантские одноламеллярные везикулы (ГУВ), были использованы для исследования взаимодействия биомолекул с мембранами. Тем не менее, сложную и динамичную природу задействованных компонентов трудно охватить только экспериментальными методами. Например, существуют ограничения на визуализацию трансмембранных доменов белков, сложность мембран, используемых в таких исследованиях, и идентификацию промежуточных или переходных состояний во время интересующего процесса^27,28,29. С момента появления молекулярного моделирования липидных монослоев и бислоев в 1980-х годах²⁹ липидно-белковые системы и их взаимодействия теперь могут быть количественно оценены на молекулярном уровне. Моделирование молекулярной динамики (МД) — это распространенный вычислительный метод, который предсказывает движение частиц на основе их межмолекулярных сил. Потенциал аддитивного взаимодействия описывает связанные и несвязанные взаимодействия между частицами системы³⁰. Набор параметров, используемых для моделирования этих взаимодействий, называется силовым полем моделирования (FF). Эти параметры получены в результате вычислений ab initio, полуэмпирических и квантово-механических расчетов и оптимизированы для воспроизведения данных рентгеновских и электронных дифракционных экспериментов, ЯМР, инфракрасной, комбинационной и нейтронной спектроскопии, а также других методов³¹.

МД-моделирование может быть использовано для исследования систем с различными уровнями разрешения^32,33,34. Системы, целью которых является характеристика конкретных биомолекулярных взаимодействий, водородных связей и других деталей с высоким разрешением, изучаются с помощью моделирования всех атомов (АА). В отличие от этого, крупнозернистое (CG) моделирование объединяет атомы в более крупные функциональные группы для снижения вычислительных затрат и^{изучения крупномасштабной} динамики. Между этими двумя моделями находятся модели объединенных атомов (UA), в которых атомы водорода объединяются с соответствующими тяжелыми атомами для ускорения вычислений^33,35. Моделирование МД является мощным инструментом для изучения динамики липидных мембран и их взаимодействия с другими молекулами и может служить для создания механизмов на молекулярном уровне для интересующих процессов на границе раздела мембран. Кроме того, МД-моделирование может служить для сужения экспериментальных мишеней и прогнозирования макромолекулярных свойств данной системы на основе микроскопических взаимодействий.

Короче говоря, имея набор начальных координат, скоростей и набор условий, таких как постоянная температура и давление, положения и скорости каждой частицы вычисляются путем численного интегрирования потенциала взаимодействия и закона движения Ньютона. Это повторяется итеративно, тем самым генерируя траекторию^{моделирования 30}. Эти вычисления выполняются с помощью движка MD; Среди нескольких пакетов с открытым исходным кодом GROMACS³⁶ является одним из наиболее часто используемых движков, и именно его мы опишем здесь. Он также включает в себя инструменты для анализа и построения начальных координат моделируемых систем³⁷. Другие двигатели MD включают NAMD³⁸; CHARMM³⁹ и AMBER⁴⁰, которые пользователь может выбрать по своему усмотрению в зависимости от вычислительной производительности данной системы. Очень важно визуализировать траектории во время моделирования, а также для анализа и интерпретации результатов. Доступны различные инструменты; Здесь мы обсудим визуальную молекулярную динамику (VMD), которая предлагает широкий спектр возможностей, включая трехмерную (3-D) визуализацию с расширенными методами рисования и раскрашивания, визуализацию объемных данных, построение, подготовку и анализ траекторий систем моделирования МД, а также создание траекторных фильмов без ограничений по размеру системы, если доступна память^41,42,43.

На точность предсказанной динамики между компонентами системы напрямую влияет ФФ, выбранный для распространения траектории. Эмпирическая параметризация ФФ предпринимается несколькими исследовательскими группами. Наиболее распространенными и распространенными FF для MD являются CHARMM³⁹, AMBER 40, Martini⁴⁴, OPLS 45 и SIRAH ⁴⁶. Силовое поле⁴⁷ из всех атомов CHARMM36 (C36) широко используется для АА МД мембранных систем, так как оно точно воспроизводит экспериментальные структурные данные. Первоначально он был разработан сообществом CHARMM и совместим с несколькими движками MD, такими как GROMACS и NAMD. Несмотря на усовершенствования во всех распространенных FF, предпринимаются постоянные усилия по совершенствованию наборов параметров, позволяющих делать прогнозы, точно воспроизводящие экспериментальные наблюдаемые объекты, что обусловлено интересами к конкретным системам исследования^48,49.

Сложность при моделировании липидных мембран заключается в определении длины траектории моделирования. Это во многом зависит от анализируемых показателей и процесса, который мы хотим охарактеризовать. Как правило, сложным липидным смесям требуется больше времени для достижения равновесия, так как большее количество видов должно иметь достаточно времени, чтобы диффундировать в плоскости мембраны и достичь стабильной латеральной организации. Моделирование называется равновесным, когда интересующее свойство достигло плато и колеблется около постоянной величины. Общепринятой практикой является получение по крайней мере 100-200 нс равновесной траектории для проведения соответствующего статистического анализа интересующих свойств и взаимодействий. Обычно моделирование только мембраны выполняется в диапазоне от 200 до 500 нс, в зависимости от сложности липидной смеси и исследовательского вопроса. Белок-липидные взаимодействия обычно требуют более длительного времени моделирования, от 500 до 2000 нс. Некоторые подходы к ускорению отбора проб и наблюдаемой динамике с помощью мембранных систем включают: (i) высокоподвижную мембранно-миметическую модель (HMMM), в которой конечные углероды липидов в мембране заменяются органическим растворителем для ускорения отбора проб⁵⁰; и (ii) перераспределение массы водорода (HMR), которое объединяет часть масс тяжелых атомов в системе с массами атомов водорода, что позволяет использовать больший временной шаг⁵¹ моделирования.

В следующем протоколе описывается удобный для начинающих подход к построению, запуску и анализу реалистичных мембранных моделей с использованием AA MD. Учитывая природу моделирования МД, необходимо использовать несколько траекторий для обеспечения воспроизводимости и надлежащего статистического анализа результатов. В настоящее время рекомендуется запускать не менее трех реплик на интересующую систему. После того, как липидные формы были выбраны для интересующего организма и процесса, основные шаги по построению, запуску и анализу траектории моделирования мембранной системы описаны и обобщены на рисунке 2.

Рисунок 2. Schematic для запуска MD-моделирования. Оранжевые прямоугольники соответствуют трем основным шагам, описанным в протоколе. Ниже показан рабочий процесс моделирования. Во время настройки системы система, содержащая начальные координаты сольватированной мембранной системы, строится с помощью системного генератора входных данных, такого как CHARMM-GUI Membrane Builder. После передачи входных файлов в кластер высокопроизводительных вычислений траектория моделирования распространяется с помощью движка MD, такого как GROMACS. Анализ траектории может быть выполнен на вычислительном кластере или локальной рабочей станции вместе с визуализацией. Затем анализ выполняется либо с помощью пакетов со встроенным кодом анализа, таких как GROMACS и VMD, либо с помощью сценариев Bash или различных библиотек Python. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Protocol

1. Построение координат системы Перейдите в CHARMM-GUI.org (C-GUI) с помощью веб-браузера. В верхнем меню перейдите в раздел Генератор входных данных, затем выберите Membrane Builder из вертикальных опций в левой части экрана. Чтобы создать двухслойный элемент, ?…

Representative Results

Для иллюстрации использования протокола и результатов, которые могут быть получены, обсуждается сравнительное исследование мембранных моделей эндоплазматического ретикулума (ЭР). В этом исследовании использовались две модели: (i) модель PI, которая содержит четыре основных вида липидо…

Discussion

Экспериментальные методы позволяют визуализировать биомолекулы с высоким разрешением с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ)⁵⁸, флуоресцентных методов и атомно-силовой микроскопии (АСМ)⁵⁹. Тем не менее, сложно уловить взаимодействие и динамику молекул…

Materials

Anaconda3	Anaconda Inc (Python & related libraries)	N/A
CHARMM-GUI.org	Im lab, Lehigh University	N/A
GROMACS	GROMACS development team	N/A
Linux HPC Cluster	UB CCR	N/A
MATLAB	MathWorks	N/A
VMD	Theoretical and Computational Biophysics Group	N/A