ड्रोसोफिला प्रमुख अणुओं का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है जो मायोजेनेसिस को नियंत्रित करता है। हालांकि, वर्तमान विधियां सिंकिटिया के भीतर एमआरएनए ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता और स्थानिक वितरण निर्धारित करने के लिए अपर्याप्त हैं। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, हम स्वस्थानी संकरण विधि में एक शाही सेना प्रतिदीप्ति अनुकूलित एक एकल अणु पैमाने पर mRNAs का पता लगाने और मात्रा का ठहराव की अनुमति.
कंकाल की मांसपेशियां बड़ी सिंकिटिया होती हैं जो कई बंडल किए गए मायोफाइबर से बनी होती हैं जो बलों का उत्पादन करती हैं और शरीर की गति को सक्षम करती हैं। ड्रोसोफिला मांसपेशी जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शास्त्रीय मॉडल है। ड्रोसोफिला आनुवंशिकी और उन्नत ओमिक्स दृष्टिकोण दोनों के संयोजन ने प्रमुख संरक्षित अणुओं की पहचान की जो मांसपेशियों की आकृति विज्ञान और उत्थान को नियंत्रित करते हैं। हालांकि, इन अणुओं की ट्रांसक्रिप्शनल गतिशीलता और सिंकिटिया के भीतर उनके मैसेंजर आरएनए के स्थानिक वितरण का आकलन पारंपरिक तरीकों से नहीं किया जा सकता है। यहां हमने वयस्क उड़ान मांसपेशियों और उनकी मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं के भीतर व्यक्तिगत एमआरएनए अणुओं का पता लगाने और मात्रा का ठहराव को सक्षम करने के लिए सीटू संकरण (एसएमफिश) विधि में एक मौजूदा एकल-अणु आरएनए प्रतिदीप्ति को अनुकूलित किया। अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हमने दो विकासवादी संरक्षित प्रतिलेखन कारकों, Mef2 और Zfh1/Zeb के mRNA अभिव्यक्ति और वितरण का विश्लेषण किया है। हम दिखाते हैं कि यह विधि मांसपेशियों के अग्रदूत कोशिकाओं, वयस्क मांसपेशियों और मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं में दोनों प्रतिलेखों के लिए एकल एमआरएनए अणुओं का कुशलतापूर्वक पता लगा सकती है और उनकी मात्रा निर्धारित कर सकती है।
वयस्क कंकाल की मांसपेशियां विभेदित बहुउद्देशीय मायोफाइबर से बनी होती हैं जिनके सिकुड़ा हुआ गुण आंदोलनों को उत्पन्न करते हैं। मांसपेशियों की वृद्धि, रखरखाव, और उत्थान मांसपेशी पूर्वज और मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं पर निर्भर (MuSCs) कि भ्रूण के विकास1 के दौरान निर्दिष्ट कर रहे हैं. मायोजेनिक कार्यक्रम को कोर मायोजेनिक ट्रांसक्रिप्शन कारकों (टीएफ) (जैसे, पैक्स 3/7, एमवाईओडी, एमईएफ 2, और जेडईबी) 2,3,4के एक सेट द्वारा बारीक रूप से नियंत्रित किया जाता है। मांसपेशियों के जीव विज्ञान को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र को समझना मौलिक मायोलॉजी से संबंधित प्रश्नों को स्पष्ट करने और मांसपेशी-अपक्षयी रोगों के इलाज में संभावित चिकित्सीय उपयोग के लिए महत्वपूर्ण है।
मायोजेनेसिस5 का अध्ययन करने के लिए आनुवंशिक मॉडल के रूप में ड्रोसोफिला का एक लंबा इतिहास है। यह हाल ही में मांसपेशियों के उत्थान 6,7,8 की जांच करने के लिए एक नए मॉडल के रूप में उभरा है। मांसपेशियों की संरचना और कोर मायोजेनिक कार्यक्रम मक्खियों और स्तनधारियों के बीच अत्यधिक संरक्षित होते हैं। उदाहरण के लिए, TFs Mef2 और Zfh1/ZEB मांसपेशियों के विकास और पुनर्जनन 3,9,10,11 को विनियमित करने में एक संरक्षित कार्य है। वयस्क ड्रोसोफिला मांसपेशियों, जैसे अप्रत्यक्ष उड़ान मांसपेशियों (आईएफएम), एमयूएससी की एक विशिष्ट आबादी से बनते हैं, जिन्हें वयस्क मांसपेशी पूर्वज (एएमपी)12के रूप में जाना जाता है। ये एएमपी भ्रूणजनन के दौरान निर्दिष्ट होते हैं और पंख और पैर डिस्क जैसे उपकला संरचनाओं के साथ संबद्ध होते हैं। भ्रूण और लार्वा चरणों के दौरान, एएमपी कायापलट तक उदासीन रहते हैं जब वे आईएफएम13,14 बनाने के लिए भेदभाव और संलयन में संलग्न होते हैं। TF स्पाल्ट प्रमुख (स्पाल्ट, सैल्म) उड़ान मांसपेशियों के विकास के दौरान व्यक्त किया जाता है और उनकी संरचनात्मक पहचान15 निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. Mef2 वयस्क मांसपेशियों के गठन16,17 के लिए आवश्यक है कि एक और महत्वपूर्ण myogenic TF है. यह एएमपी में व्यक्त किया जाता है और वयस्क आईएफएम10,18 में बनाए रखा जाता है। जबकि अधिकांश एएमपी कार्यात्मक मांसपेशियों में अंतर करते हैं, एक सबसेट भेदभाव से बच जाता है और वयस्क म्यूएससी11 बनाता है। कशेरुकियों के समान, TF Zfh1/ZEB वयस्क MuSCs के समय से पहले भेदभाव को रोकने और उनके तने 9,10 को बनाए रखने के लिए आवश्यक है।
जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता विभिन्न मांसपेशी जैविक प्रक्रियाओं19,20 को विनियमित करने के लिए सिद्ध किया गया है. उच्च-थ्रूपुट एकल-कोशिका और एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण तकनीकों के आगमन ने इन ट्रांसक्रिप्शनल डायनेमिक्स21,22की व्यापक खोज को सक्षम किया है। इन दृष्टिकोणों की एक उल्लेखनीय सीमा बहुउद्देशीय मांसपेशी फाइबर में एमआरएनए अणुओं के स्थानिक वितरण प्रदान करने में असमर्थता है। इन विशेषताओं की जांच स्वस्थानी संकरण (smFISH) में एकल-अणु प्रतिदीप्ति द्वारा की जा सकती है जो दो प्रकार के mRNA निकायों को प्रकट करती है: 1. व्यक्तिगत mRNA अणु साइटोप्लाज्म में फैलते हैं और परिपक्व RNA का प्रतिनिधित्व करते हैं और 2. अधिकतम दो उज्ज्वल परमाणु foci नवजात प्रतिलेख के अनुरूप हैं और ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय एलील23 को प्रकट करते हैं। इसलिए, smFISH व्यक्तिगत mRNA अणु मात्रा का ठहराव के लिए पसंद की एक विधि है, उनके स्थानिक वितरण की जांच करना और जीन ट्रांसक्रिप्शनल डायनामिक्स के स्नैपशॉट प्रदान करना।
smFISH विधि विशेष रूप से लक्ष्य प्रतिलेख के पूरक होने के लिए डिज़ाइन किए गए लघु फ्लोरोसेंट ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के एक सेट पर निर्भर करती है। एनीलिंग पर, यह उच्च तीव्रता बिंदु स्रोतों को उत्पन्न करता है जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी24 का उपयोग करके एकल-अणु स्तर पर एमआरएनए का पता लगाने की अनुमति देता है। इस विधि तेजी से स्तनधारी मांसपेशियों के ऊतकों19,20 सहित सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया जाता है. हालांकि, ड्रोसोफिला में अन्य पशु मॉडल की तरह, वयस्क मांसपेशी जीन अभिव्यक्ति के बारे में अधिकांश ज्ञान थोक आणविक परख से लिया गया है, जिसमें एमआरएनए अणुओं के स्थानिक स्थान पर मात्रात्मक जानकारी का अभाव है। यहाँ हम मांसपेशियों अग्रदूत कोशिकाओं और वयस्क ड्रोसोफिला मांसपेशियों23,25 पर smFISH प्रदर्शन के लिए एक विधि अनुकूलित. इस प्रोटोकॉल नाभिक विभाजन और mRNA गिनती और स्थानीयकरण के लिए एक पूरी तरह से स्वचालित विश्लेषण पाइपलाइन भी शामिल है.
smFISH विधि के अनुप्रयोग ने हाल के दिनों में लोकप्रियता हासिल की है, इसका उपयोग विभिन्न सेल प्रकारों और मॉडल जीवों तक फैला हुआ है। हालांकि, ड्रोसोफिला के मामले में, वयस्क मांसपेशी जीन अभिव्यक्ति के बारे में अधिकांश ज्ञान थोक आणविक परख से लिया गया है, जो एमआरएनए अणुओं के सटीक स्थानिक स्थान पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने में विफल रहता है। इस अंतर को संबोधित करने के लिए, हमने मांसपेशियों के अग्रदूत कोशिकाओं और वयस्क ड्रोसोफिला मांसपेशियों पर smFISH प्रदर्शन करने के लिए एक विधि को अनुकूलित किया है। इस दृष्टिकोण को पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल23 से अनुकूलित किया गया है और ड्रोसोफिला मांसपेशियों के ऊतकों के लिए अनुकूलित किया गया है।
उच्च गुणवत्ता वाली smFISH छवियों को प्राप्त करने में प्रमुख बाधा वयस्क मांसपेशियों की मोटाई है, जो जांच के इष्टतम प्रवेश में बाधा डालती है। इसलिए, वयस्क मांसपेशियों को जानवर के अन्य ऊतकों से अलग करना और हल्के आंदोलन के साथ संकरण प्रक्रिया को पूरा करना महत्वपूर्ण है। यह विशेष कदम ऊतकों के प्रभावी पारगम्यता सुनिश्चित करता है।
एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू यह है कि सिग्नल-टू-शोर अनुपात कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन को कुछ एमआरएनए स्पॉट का पता लगाने में विफल कर सकता है। हमने पाया कि सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बढ़ाकर जांच की इष्टतम एकाग्रता का पता लगाकर प्राप्त किया जा सकता है। इष्टतम कमजोर पड़ने प्रत्येक जांच सेट की संरचना के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, संयुग्मित डाई और oligonucleotide संरचना सहित. हम विभिन्न dilutions की कोशिश करने की सलाह देते हैं; 200 एनएम के एक अंतिम कमजोर पड़ने इन प्रयोगों में वयस्क ऊतकों के लिए सबसे अच्छा संकेत करने के लिए शोर अनुपात उपज.
smFISH विधि के साथ, TS foci पर नव संश्लेषित RNAs की संख्या निर्धारित करना संभव है। जब एक जीन को सक्रिय रूप से स्थानांतरित किया जाता है, तो टीएस पर समवर्ती रूप से कई नवजात आरएनए उत्पन्न होते हैं। नतीजतन, टीएस की तीव्रता परिपक्व साइटोप्लाज्मिक आरएनए को पार कर जाएगी, और यह विशेषता, इसके परमाणु स्थानीयकरण के साथ मिलकर, टीएस को व्यक्तिगत साइटोप्लाज्मिक आरएनए से अलग कर सकती है। मांसपेशी जीव विज्ञान के संदर्भ में, टीएस का पता लगाने और मात्रा का ठहराव एक ही सिंकिटियम के भीतर मांसपेशियों के नाभिक के बीच एक विशिष्ट जीन के प्रतिलेखन के सिंक्रनाइज़ेशन का निर्धारण करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। हालांकि, इस कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन को साइटोप्लाज्मिक एमआरएनए और टीएस संकेतों के बीच अंतर करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है। एक विकल्प के रूप में, हम इस smFISH विधि को अन्य अच्छी तरह से स्थापित smFISH विश्लेषण उपकरण, जैसे BayFISH या FISH-quant29,30 के साथ संयोजित करने का सुझाव देते हैं। इन उपकरणों को उल्लेखनीय परिशुद्धता के साथ आरएनए समुच्चय के स्वचालित विभाजन और प्रतिदीप्ति तीव्रता गणना की सुविधा प्रदान करने के लिए सिद्ध किया गया है।
अंत में, जबकि smFISH उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन वाले mRNA अणुओं का पता लगाता है, यह एक ही समय में mRNA की एक छोटी संख्या का विश्लेषण करने तक सीमित है। merFISH ( स्वस्थानी संकरण में मल्टीप्लेक्स त्रुटि-मजबूत प्रतिदीप्ति) की तरह multiscale तरीकों विभिन्न mRNA31 की एक बड़ी संख्या के एक साथ विश्लेषण सक्षम. ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच और त्रुटि-सुधार कोड के संयोजन से, यह विधि एकल कोशिकाओं में सैकड़ों आरएनए प्रजातियों का पता लगाने की सुविधा प्रदान करती है।
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एलेन विंसेंट धन्यवाद. हम Zfh1 एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए रूथ लेहमैन को धन्यवाद देते हैं। हम एमआरआईसी इमेजिंग प्लेटफॉर्म पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए स्टेफ़नी डुटर्ट्रे और जेवियर पिंसन की मदद स्वीकार करते हैं। ईएल को पीएचडी फेलोशिप द्वारा मिनिस्टेयर डी ल’एनसिग्नेमेंट सुप्रीयर एट डे ला रीचर्चे साइंटिफिक से समर्थित है। एनए एएफएम-टेलीथॉन पीएचडी फेलोशिप 23846 द्वारा समर्थित है। टीपी को चैन जुकरबर्ग इनिशिएटिव डीएएफ अनुदान द्वारा टीपी (2019-198009) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। HB CNRS, Atip Avenir प्रोग्राम और AFM-Telethon trampoline grant 23108 द्वारा समर्थित है।
Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
Mef2 antibody | DHSB | NA | |
PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
Stellaris probes | LGC | NA | |
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |