Drosophila är en väletablerad modell för att studera nyckelmolekyler som reglerar myogenes. Nuvarande metoder är dock otillräckliga för att bestämma mRNA-transkriptionsdynamik och rumslig fördelning inom syncytia. För att ta itu med denna begränsning optimerade vi en RNA-fluorescens in situ-hybridiseringsmetod som möjliggör detektion och kvantifiering av mRNA på en skala med en enda molekyl.
Skelettmuskler är stora syncytier som består av många buntade myofibrer som producerar krafter och möjliggör kroppsrörelse. Drosophila är en klassisk modell för att studera muskelbiologi. Kombinationen av både Drosophila-genetik och avancerade omics-metoder ledde till identifieringen av viktiga bevarade molekyler som reglerar muskelmorfogenes och regenerering. Transkriptionsdynamiken hos dessa molekyler och den rumsliga fördelningen av deras budbärar-RNA inom syncytian kan dock inte bedömas med konventionella metoder. Här optimerade vi en befintlig enmolekylär RNA-fluorescens in situ-hybridiseringsmetod (smFISH) för att möjliggöra detektion och kvantifiering av enskilda mRNA-molekyler i vuxna flygmuskler och deras muskelstamceller. Som ett proof of concept har vi analyserat mRNA-uttrycket och fördelningen av två evolutionära bevarade transkriptionsfaktorer, Mef2 och Zfh1/Zeb. Vi visar att denna metod effektivt kan detektera och kvantifiera enstaka mRNA-molekyler för både transkript i muskelprekursorceller, vuxna muskler och muskelstamceller.
Vuxna skelettmuskler är gjorda av differentierade multinukleära myofibrer vars sammandragande egenskaper genererar rörelser. Muskeltillväxt, underhåll och regenerering är beroende av muskelstamceller och muskelstamceller (MuSC) som specificeras under embryonal utveckling1. Det myogena programmet styrs fint av en uppsättning centrala myogena transkriptionsfaktorer (TF) (t.ex. Pax3/7, MYOD, Mef2 och ZEB)2,3,4. Att dechiffrera de molekylära mekanismer som reglerar muskelbiologi är viktigt för att belysa grundläggande myologirelaterade frågor och för möjlig terapeutisk användning vid behandling av muskeldegenerativa sjukdomar.
Drosophila har en lång historia som genetisk modell för att studera myogenes5. Det har nyligen dykt upp som en ny modell för att undersöka muskelregenerering 6,7,8. Muskelstrukturen och de myogena kärnprogrammen är mycket bevarade mellan flugor och däggdjur. Till exempel har TF Mef2 och Zfh1/ZEB en bevarad funktion för att reglera muskelutveckling och regenerering 3,9,10,11. Vuxna Drosophila-muskler, såsom Indirect Flight Muscles (IFM), bildas från en specifik population av MuSCs, känd som Adult Muscle Progenitors (AMPs)12. Dessa AMP specificeras under embryogenesen och associeras med epitelstrukturer såsom ving- och benskivor. Under embryonala stadier och larvstadier förblir AMP odifferentierade fram till metamorfos då de deltar i differentiering och fusion för att bilda IFMs13,14. TF Spalt major (spalt, salm) uttrycks under flygmuskelutveckling och är nödvändig för att bestämma deras strukturella identitet15. Mef2 är en annan viktig myogen TF som är avgörande för vuxen muskelbildning16,17. Den uttrycks i AMP och upprätthålls i IFMför vuxna 10,18. Medan majoriteten av AMPs differentieras till funktionella muskler, undgår en delmängd differentiering och bildar de vuxna MuSCs11. I likhet med ryggradsdjur krävs TF Zfh1/ZEB för att förhindra för tidig differentiering av de vuxna MuSC och för att bibehålla deras stam 9,10.
Genuttrycksdynamik har visat sig reglera olika muskelbiologiska processer19,20. Tillkomsten av RNA-sekvenseringstekniker med hög genomströmning av encelliga och enskilda kärnor har möjliggjort en omfattande utforskning av denna transkriptionsdynamik21,22. En anmärkningsvärd begränsning med dessa tillvägagångssätt är deras oförmåga att tillhandahålla den rumsliga fördelningen av mRNA-molekyler i de multinukleära muskelfibrerna. Dessa egenskaper kan undersökas genom fluorescens in situ-hybridisering (smFISH) som avslöjar två typer av mRNA-kroppar: 1. Enskilda mRNA-molekyler utspridda i cytoplasman och representerar det mogna RNA:t och 2. Maximalt två ljusa kärnhärdar motsvarar det begynnande transkriptet och avslöjar de transkriptionellt aktiva allelerna23. Därför är smFISH en metod för kvantifiering av enskilda mRNA-molekyler, som undersöker deras rumsliga fördelning och ger ögonblicksbilder av gentranskriptionsdynamiken.
smFISH-metoden bygger på en uppsättning korta fluorescerande oligonukleotidsonder som är särskilt utformade för att vara komplementära till måltranskriptet. Vid glödgning genererar den högintensiva punktkällor som möjliggör detektion av mRNA på en enda molekylnivå med hjälp av konfokalmikroskopi24. Denna metod används i allt högre grad för en mängd olika celltyper, inklusive däggdjurs muskelvävnader 19,20. Men i Drosophila, liksom i andra djurmodeller, kommer det mesta av kunskapen om genuttryck i vuxna muskler från molekylära bulkanalyser, som saknar kvantitativ information om mRNA-molekylernas rumsliga placering. Här optimerade vi en metod för att utföra smFISH på muskelprekursorceller och vuxna Drosophila-muskler 23,25. Detta protokoll innehåller en helautomatisk analyspipeline för segmentering av kärnor och räkning och lokalisering av mRNA.
Tillämpningen av smFISH-metoden har blivit populär på senare tid, och dess användning sträcker sig till olika celltyper och modellorganismer. Men när det gäller Drosophila kommer majoriteten av kunskapen om genuttryck för vuxna muskler från molekylära bulkanalyser, som inte ger kvantitativ information om den exakta rumsliga placeringen av mRNA-molekyler. För att ta itu med detta gap har vi optimerat en metod för att utföra smFISH på muskelprekursorceller och vuxna Drosophila-muskler . Detta tillvägagångssätt har anpassats från ett tidigare publicerat protokoll23 och optimerats för Drosophilas muskelvävnader.
Det största hindret för att få högkvalitativa smFISH-bilder är tjockleken på vuxna muskler, vilket hindrar optimal penetration av sonder. Därför är det viktigt att separera de vuxna musklerna från djurets andra vävnader och utföra hybridiseringsprocessen med mild omrörning. Detta speciella steg säkerställer effektiv permeabilisering av vävnaderna.
En annan kritisk aspekt är att signal-brusförhållandet kan göra att beräkningspipelinen misslyckas med att detektera vissa mRNA-fläckar. Vi fann att en ökning av signal-brusförhållandet kan uppnås genom att hitta den optimala koncentrationen av sonder. Den optimala utspädningen kan variera beroende på sammansättningen av varje sonduppsättning, inklusive det konjugerade färgämnet och oligonukleotidsammansättningen. Vi rekommenderar att du provar olika spädningar; En slutlig utspädning på 200 nM gav det bästa signal-brusförhållandet för vuxna vävnader i dessa experiment.
Med smFISH-metoden är det möjligt att kvantifiera antalet nysyntetiserade RNA vid TS-härdarna. När en gen transkriberas aktivt produceras flera begynnande RNA samtidigt vid TS. Som ett resultat kommer TS:s intensitet att överträffa den för moget cytoplasmatiskt RNA, och denna funktion, i kombination med dess kärnlokalisering, kan skilja TS från enskilda cytoplasmatiska RNA. I samband med muskelbiologi är TS-detektion och kvantifiering särskilt viktig för att bestämma synkroniseringen av transkriptionen av en specifik gen bland muskelkärnor inom samma syncytium. Denna beräkningspipeline är dock inte utformad för att skilja mellan cytoplasmatiska mRNA- och TS-signaler. Som ett alternativ föreslår vi att man kombinerar denna smFISH-metod med andra väletablerade smFISH-analysverktyg, såsom BayFISH eller FISH-quant29,30. Dessa verktyg har visat sig underlätta automatiserad segmentering och fluorescensintensitetsberäkningar av RNA-aggregat med anmärkningsvärd precision.
Slutligen, medan smFISH detekterar mRNA-molekyler med hög rumslig upplösning, är den begränsad till att analysera ett litet antal mRNA samtidigt. Flerskaliga metoder som merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) möjliggör samtidig analys av ett stort antal olika mRNA31. Genom att kombinera oligonukleotidprober och felrättande koder underlättar denna metod detektion av hundratals RNA-arter i enskilda celler.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Alain Vincent för hans kritiska läsning av manuskriptet. Vi tackar Ruth Lehmann för att ha tillhandahållit Zfh1-antikroppen. Vi tackar Stephanie Dutertre och Xavier Pinson för konfokalmikroskopi vid MRic Imaging Platform. EL stöds av ett doktorandstipendium från ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique. NA stöds av AFM-Telethon Ph.D. fellowship 23846. TP finansieras av ett Chan Zuckerberg Initiative DAF-bidrag till T.P. (2019-198009). HB stöds av CNRS, Atip Avenir-programmet och AFM-Telethon trampolinbidrag 23108.
Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
Mef2 antibody | DHSB | NA | |
PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
Stellaris probes | LGC | NA | |
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |